复方仙草颗粒的质量标准研究

黄国东，顾敬文，莫宇凤，吴雨蓉，陈 夏

（1.广西国际壮医医院，广西 南宁 530201；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）

复方仙草颗粒处方来源于临床经验方，主要由八仙草、三七、薏苡仁等广西特色中草药组成，具有健脾益肾、清热活血、利湿解毒的功效。临床研究表明，复方仙草颗粒对治疗慢性原发性肾小球疾病及慢性肾功能衰竭和早期的糖尿病肾病有较好的疗效［1-5］，其可能通过降低Smads2 蛋白、上调Smad7 蛋白的表达，调整免疫、抗炎、抗凝及脂代谢紊乱，激活PI3K∕Akt∕mTOR信号通路等机制，而发挥抑制炎症、保护肾足细胞、减少蛋白尿、抗肾纤维化、延缓肾小球硬化持续进展的作用［6-15］。经临床观察，该方毒副作用小，治疗费用经济，适用于患者长期服用，本课题组拟将其开发为颗粒剂。基于此，本研究采用显微鉴别法和薄层色谱法（TLC）对该制剂中三七、大黄进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法（HPLC）对该制剂中人参皂苷Rb1进行含量测定，以期全面、综合的评价该制剂质量，为临床用药提供保障。

1 实验材料

1.1 仪器 Ni-U 尼康高级生物显微镜；视频成像装置拍摄成像仪；Agilent1260 高效液相色谱仪；高压四元梯度泵（G-1311C）；标准自动进样器（G-1329B）；柱温箱（AT-950）；检测器（G-1314-60101）；XS205DU十万分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-300DB超声机（昆山市超声仪器有限公司）；Hitech超纯水器（和泰公司）。

1.2 试剂与试药 复方仙草颗粒（自制3 批，批号：20180201、20180202、20180203）；硅胶G 薄层预制板（青岛海洋化工分厂，批号：20180108）；人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201625）、人参皂苷Rg1 对照品（批号：110703-201530）、大黄对照药材（批号：120984-201202）、大黄酸对照品（批号：0757-9804）、大黄素对照品（批号：110756-200110）均购自中国食品药品检定研究院；流动相所用甲醇和乙腈均为色谱纯（美国默克有限公司）；正丁醇、甲醇、95%乙醇、无水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、乙醚、氨水、二氯甲烷、氯仿，均为市售分析纯试剂；超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 制剂中的三七药材是以原药材粉末存在的，故对三七粉末进行显微鉴别。试验中取3 个批号制剂样品，分别装片，置生物显微镜下观察，显微特征如下：导管主要是梯纹和网纹导管，螺纹较少或不明显，直径15～55 μm；可见树脂道碎片，内含棕黄色分泌物；未见淀粉粒及草酸钙簇晶。结果见图1-4。上述结果基本符合2015年版《中华人民共和国药典》规定的三七显微特征，其中未见淀粉粒是因为三七粉末经过高温加热后，淀粉粒已糊化，故未能观察到淀粉粒。

图1 梯纹导管

图2 网纹导管

图3 螺纹导管

图4 树脂道

2.2 薄层鉴别

2.2.1 三七的薄层鉴别 取本品粉末2.5 g，加水2 ml，搅匀，再加以水饱和的正丁醇20 ml，超声10 min，放置2 h，离心，取上清液，加3 倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，放置使分层（必要时离心），取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。阴性溶液制备：取除三七外其余药材，按处方量的1∕10 制备得阴性样品，取2.5 g按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。另取人参皂苷Rb1对照品和人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg 的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2015 年版通则0502）［16］试验，吸取供试品溶液和阴性供试品溶液各2 μl、对照品溶液4 μl 分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）在10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸溶液（1→10），在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果3 批样品供试液色谱中，在与对照品混合溶液对应的位置上，显相同的红紫色斑点，且薄层色谱分离效果好，阴性溶液在与对照品混合溶液相应的位置上无斑点。说明本法重现性好、无阴性干扰，专属性强。见图5。

图5 复方仙草颗粒中三七药材TLC色谱图

2.2.2 大黄的薄层鉴别 取本品5 g，研细，加甲醇20 ml，浸泡1 h，滤过，取滤液5 ml，蒸干，残渣加水10 ml使溶解，再加盐酸1 ml，加热回流30 min，立即冷却，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。阴性溶液制备：按处方量的1∕10 称取缺大黄的其他药味，按供试品制备方法制成却大黄的阴性制剂。取5 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。另取大黄对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。取大黄酸对照品适量，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为大黄酸对照品溶液。再取大黄素对照品适量，加三氯甲烷制成每1 ml 含0.3 mg 的溶液，作为大黄素对照品溶液。照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2015 年版通则0502）［16］试验，吸取上述供试品溶液3 μl、对照药材溶液2 μl、大黄酸对照品溶液3 μl、大黄素对照品溶液1 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。结果：置紫外光灯（365 nm）下检视，3批供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。且阴性溶液在对照药材溶液和对照品溶液相应的位置上无斑点。表明本法重现性好、无阴性干扰，专属性强。见图6。

图6 复方仙草颗粒中大黄药材TLC色谱图

2.3 人参皂苷Rb1的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦Eclipse XDB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相：乙腈-水（27∶72）；检测波长：203 nm；流速：1.0 ml∕min；进样量：10 μl。

2.3.2 供试品溶液的制备 提取条件的优化：采用正交试验方法，选择提取回流时间（A）、甲醇浓度（B）、样品称取量（C）作为考察因素，每因素设3 水平（表1），按L9（34）正交表安排的9 种工艺，以人参皂苷Rb1 含量（%）作为考察指标，优化供试液制备的条件。结果见表2、表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验与结果

（续表2）

表3 方差分析结果

根据表2、表3 结果，从极差R 分析，B＞C＞A；其中甲醇溶剂浓度的变化对人参皂苷Rb1 含量具有显著影响，回流时间和样品称取量的变化则无显著影响。再结合A2＞A1＞A3、B3＞B2＞B1、C1＞C3＞C2，最终确定供试品溶液的制备工艺为：A2B3C1，即取本品粉末3 g，精密称定，精密加入60%甲醇50 ml，称定重量，放置过夜，置80 ℃水浴上微沸2 h，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.3.3 阴性溶液的制备 按处方量的1∕10 称取除三七外的其余药材，制备缺三七的阴性制剂，再按2.3.2供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3.4 对照品溶液的制备 取人参皂苷Rb1 对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成1 ml 含人参皂苷Rb1 0.4 mg的溶液，即得。

2.3.5 系统适应性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图7）。结果理论板数按人参皂苷Rb1 峰计算应不低于3 000；基线分离良好，分离度均大于1.5。

图7 复方仙草颗粒中人参皂苷Rb1含量测定HPLC图

2.3.6 线性性考察及线性范围 人参皂苷Rb1 对照品溶液的制备：取人参皂苷Rb1 对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成人参皂苷Rb1 甲醇溶液（浓度为1.045 mg∕ml），备用。分别精密吸取上述人参皂苷Rb1对照品溶液0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml，各置5 ml量瓶中，加60%甲醇至刻度，摇匀，作为不同浓度的系列对照品溶液。精密吸取上述不同浓度的系列对照品溶液各10 μl，进样，测定，以对照品的进样量（µg）为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=243.96X-27.9（r=0.9999）。结果显示，人参皂苷Rb1 对照品进样量在1.045～10.45 μg 范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.7 重复性试验 取同一供试品溶液（批号：20180201），连续进样测定6 次。结果：6 次测定的人参皂苷Rb1 峰面积分别为925.2、914.3、935.8、920.3、929.3、919.9，平均峰面积值为924.1，RSD=0.82%（n=6）。表明本法的重复性良好。

2.3.8 重现性试验 取同一批样品（批号20180201）约3 g，共6份，各精密称定，按2.3.2项的方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样测定。结果：6 份样品测得人参皂苷Rb1 含量分别为5.962 mg∕g、6.011 mg∕g、6.041 mg∕g、5.995 mg∕g、5.986 mg∕g、6.015 mg∕g，人参皂苷Rb1 的平均含量为6.002 mg∕g，RSD= 0.45%（n=6）。表明本法的重现性良好。

2.3.9 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号20180201），照2.3.1 项测定条件，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 进样测定。结果：6 个不同时间测定的人参皂苷Rb1 含量分别为5.973 mg∕g、5.980 mg∕g、6.062 mg∕g、6.048 mg∕g、6.072 mg∕g、5.920 mg∕g，人参皂苷Rb1 的平均含量为6.009 mg∕g ，RSD=1.00%（n=6）；表明供试品溶液中所含人参皂苷Rb1 在24 h 内是稳定的。

2.3.10 加样回收率试验 精密称取人参皂苷Rb1 对照品适量，置于500 ml容量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，摇匀，得人参皂苷Rb1对照品溶液（0.2168 mg∕ml），备用。取已知人参皂苷Rb1含量的同一批样品（20180201）约1.75 g 共6 份，置50 ml 量瓶中，精密称定，分别加入上述人参皂苷Rb1 对照品溶液至刻度，摇匀。照2.3.1项拟定的条件测定，计算加样回收率。结果：人参皂苷Rb1平均回收率为100.02%，RSD=1.45%（n=6）。见表4。

2.3.11 样品测定 取3 批样品各适量，分别按2.3.2项下方法制备供试品溶液，再按2.3.1项下色谱条件进样平行测定2 次，记录峰面积并计算样品中人参皂苷Rb1含量，结果见表5。

表4 加样回收率试验结果 （n=6）

表5 3批复方仙草颗粒含量测定结果（n=2）

3 讨 论

试验中曾对制剂中猪殃殃、黄芪、甘草等进行薄层鉴别，由于分离度达不到要求，或存在阴性干扰，故不作为该颗粒剂质量标准的指标。因此本试验对复方仙草颗粒中三七的显微特征和三七、大黄2 种药材的薄层色谱进行研究。结果显示，三七的显微特征明显。薄层色谱中样品供试液在与对照品溶液（对照药材溶液）相对应的位置显相同的颜色和斑点，阴性无干扰，重现性好。

三七在处方中为臣药。据文献报道，三七含有皂苷类、黄酮类、挥发油类、氨基酸类、多糖类等化学成分以及各种微量元素，其中人参皂苷Rg1、Rb1、R1 为三七主要有效成分［17-18］，为提高本品质量控制水平，应对这些成分进行含量测定。试验中，我们曾摸索Rg1、Rb1、R1 成分的含量测定方法，结果：Rg1、R1 存在阴性干扰，故考虑本品只对其中的人参皂苷Rb1 含量进行质量控制。经全波长扫描结果显示，人参皂苷Rb1 在203 nm 波长处有最大吸收，因此选择203 nm作为检测波长。

本文采用HPLC 法测定人参皂苷Rb1 含量，经方法学考察，本方法专属性强，无阴性干扰，精密度和准确度均较高，具有良好的重复性和重现性，平均回收率达到100.02%，说明本文建立的含量测定方法可行，可用于复方仙草颗粒的质量控制。