miR-503-5p靶向bFGF对人膀胱癌T24细胞侵袭和迁移的调节作用①

刘昌明 黄香尘 杜 斌

(雅安职业技术学院病理教研室，雅安625000)

膀胱癌是泌尿系统最常见的发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，其发病率居全球恶性肿瘤的第9位，并有逐年增长的趋势[1]。而miR-503是一种在染色体Xq26.3位点与miRNA-424结合的基因内小RNA，其与乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌和肺癌等多种癌症的发生和发展相关[2]。但关于miR-503-5p的报道并不多，主要是抑制成骨分化和肿瘤细胞增殖[3-5]。并已有报道发现miR-503-5p通过干扰Rb/E2F信号通路来抑制膀胱癌细胞T24的增殖[4]，但miR-503-5p对膀胱癌细胞T24的侵袭和迁移的作用及机制并不清楚。碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor ，bFGF)能够促进肿瘤细胞的迁移，诱导肿瘤相关成纤维细胞分化，促进肿瘤的生长[6]。Horstmann等[7]发现bFGF的表达程度反映了肾癌的侵袭性，Li等[8]研究发现bFGF通过诱导调控Ets-1和uPA的表达增强体外卵巢癌细胞的侵袭能力，所以bFGF和肿瘤细胞的侵袭迁移具有一定关系。本文主要研究miR-503-5p对膀胱癌细胞T24侵袭和迁移的调节作用及机制，为后期膀胱癌的治疗和诊断提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1材料 人膀胱癌细胞T24购自上海雅吉生物科技有限公司；RPMI1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco BRL公司；miR-503-5p mimic、pcDNA-bFGF质粒由上海生工生物工程有限公司合成。LipofectamineTM2000 转染试剂盒购自美国ABI公司；Dual Luciferase报告基因试剂盒购自上海前尘生物科技有限公司；Transwell小室购自美国 Corning 公司；BCA试剂盒购自北京天根生化有限公司；鼠购自四川大学生物治疗国家重点实验室[许可证：SYXK(川)2016-178]。

1.2方法

1.2.1靶基因预测 运用在线基因预测软件：TargetScan (http://www.targetscan.org)和miRanda(http://www.microna.org/microrna/home.do)预测miR-503-5p的靶基因。

1.2.2细胞培养与转染 人膀胱癌细胞T24于含10% 胎牛血清和100 mg/L青霉素/链霉素的RPMI1640培养液中，在5%CO2、37℃恒温的培养箱中培养。膀胱癌细胞T24培养24 h后，利用LipofectamineTM2000 转染试剂盒进行转染，将miR-503-5p mimic和pcDNA-bFGF单独或联合转染膀胱癌细胞T24。

1.2.3RT-PCR 用Trizol试剂提取细胞或组织的总RNA，按试剂盒说明逆转录为cDNA，进行RT-PCR检测。反应条件为：95℃预变性3 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，共35个循环；4℃保存。miR-503-5p引物，由生工生物工程上海股份有限公司采用PolyA 加尾法设计合成；bFGF上游引物：5′-CACCAACTGCAGATGGCAGCCGGG-AGCATC-3′，bFGF下游引物：5′-ACGCGTCGACTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAA-3′。β-actin作为内参，应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One 软件进行扫描分析，计算采用2-ΔΔCt法。

1.2.4双荧光素酶报告实验 用miR-503-5p mimic、pc-DNA、pcDNA-bFGFwt和pcDNA-bFGFmut分别或同时对细胞进行转染，以海肾荧光素酶的荧光值作为内参，按照Dual Luciferase报告基因试剂盒说明书进行。

1.2.5Transwell检测 接种膀胱癌细胞T24细胞悬液100 μl/室于Transwell小室上室，使transwell小室上室细胞终浓度为8×104个/室。然后，向下室加入750 μl 含血清培养基。最后，在培养48 h后取出Transwell 小室，用结晶紫染色，显微镜下随机拍照，收集试验数据分析。

1.2.6划痕实验 将各组膀胱癌细胞T24消化铺满单层后用小号枪头垂直划痕，在5%CO2、37℃恒温培养箱培养24 h后，分别在显微镜下拍照，用 Image J 软件分析。

1.2.7Western blot检测 膀胱癌细胞T24裂解变性后，用BCA试剂盒检测蛋白含量。取25 μg总蛋白，经10% SDS-PAGE分离并转印至 PVDF膜后,在室温下用 5% 脱脂奶粉封闭 1 h,加入对应一抗,4℃孵育过夜,用 PBS 洗膜后加入二抗并在室温下孵育 1 h 后,加入 ECL曝光。

1.2.8体内实验 将裸鼠随机分为Ctrl组和miR-503-5p mimic组，每组18只，雌雄各半。然后，在各组裸鼠右后肢腹侧皮下分别注射 0.2 ml的1×107个/ml膀胱癌细胞T24和转染miR-503-5p mimic的膀胱癌细胞T24悬液。接着，继续在SPF条件下正常饮食饲养，观察裸鼠皮下成瘤情况。第30天颈椎脱位法处死裸鼠，完整取出皮下肿瘤，电子天平称重。组织一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，一半置于液氮中冻存。

1.2.9免疫组化 膀胱癌细胞T24移植肿瘤组织经甲醛固定、石蜡包埋切片后，脱蜡水化，过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清阻断非特异性反应，分别加入鼠抗人Ki67和β-catenin单抗，在4℃下过夜。然后，滴加生物素标记二抗，用DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片观察统计。

2 结果

2.1预测miR-503-5p的靶向关系 通过基因预测软件TargetScan和miRanda筛选出bFGF作为miR-503-5p的靶基因，miR-503-5p与bFGF在3′UTR区存在结合位点(图1A)。

RT-PCR检测miR-503-5p的表达结果表明：与Control组相比，mimic-NG组miR-503-5p表达量无明显变化，miR-503-5p mimic组miR-503-5p表达量显著上调，说明mimic-NG对实验无影响，miR-503-5p mimic转染成功(P<0.01,图1B)。

RT-PCR检测bFGF的表达结果表明：与Control组相比，miR-503-5p mimic组bFGF表达量显著下调，bFGF组bFGF表达量显著上调，说明miR-503-5p mimic对bFGF具有抑制作用，pcDNA-bFGF能使bFGF过表达；mimic+bFGF组bFGF的表达量，和Control组无明显变化，比miR-503-5p mimic组显著上调，比bFGF组显著下调，说明miR-503-5p和bFGF具有靶向关系，并且过表达miR-503-5p抑制bFGF表达(P<0.01,图1C)。

为了进一步验证miR-503-5p直接作用于bFGF，进行了荧光素酶报告基因实验。结果表明：miR-503-5p对野生型bFGF表达有明显下调作用，对突变型没有明显作用，提示miR-503-5p直接靶向作用于bFGF(P<0.01,图1D)。

2.2miR-503-5p过表达抑制膀胱癌细胞T24侵袭 通过Transwell检测细胞侵袭情况可知：与Control组相比，miR-503-5p mimic组侵袭细胞数目显著减少，bFGF组侵袭细胞数目显著增多，说明过表达miR-503-5p可以降低膀胱癌细胞T24的侵袭能力，过表达bFGF增强膀胱癌细胞T24侵袭能力；mimic+bFGF组的侵袭细胞数目，与Control组无显著差异，比miR-503-5p mimic组显著增多，比bFGF组显著降低，这说明过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达进而来抑制膀胱癌细胞T24细胞侵袭(P<0.01,图2A、B)。

图1 miR-503-5p靶向作用于bFGFFig.1 miR-503-5p targets to bFGFNote: A.The target genes of miR-503-5p were screened by the gene prediction software TargetScan and miRanda;B.The expression of miR-503-5p was detected by RT-PCR;C.The expression of bFGF was detected by RT-PCR；D.Targeting relationship was detected by luciferase activity;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group;&&.P<0.01 versus transfected pc-DNA group.

2.3miR-503-5p过表达抑制膀胱癌细胞T24迁移 划痕实验结果表明：miR-503-5p mimic组比Control组划痕宽，闭合率显著降低，说明过表达miR-503-5p可以抑制膀胱癌细胞T24迁移；bFGF组比Ctrl组细划痕窄，闭合率显著升高，说明过表达bFGF可以增强膀胱癌细胞T24迁移能力；mimic+bFGF组划痕，比Control组划痕宽、闭合率降低，比miR-503-5p mimic组划痕窄、闭合率显著升高，比bFGF组划痕宽、闭合率降低，这说明过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达来降低膀胱癌细胞T24迁移能力(P<0.01,图3)。

图2 Transwell检测细胞侵袭情况(×400)Fig.2 Detection of cell invasion detected by Transwell(×400)Note: **.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group.

图3 划痕实验检测细胞迁移能力Fig.3 Cell migration ability was detected by scratch testNote: **.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group.

图4 Western blot检测β-catenin、E-caderin和N-cadherin的表达Fig.4 β-catenin,E-cadherin,N-cadherin expression was detected by Western blotNote: **.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus the single transfection group.

图5 裸鼠体内实验结果Fig.5 Experimental results in mouseNote: A.Tumor size photo;B.Tumor weight statistics;C.miR-503-5p expression was detected by RT-PCR;D,E.Ki67 and β-catenin were detected by immunohistochemistry;**.P<0.01 versus control group.

2.4miR-503-5p过表达抑制膀胱癌细胞T24上皮-间充质转化 通过Western blot检测β-catenin、E-cadherin和N-cadherin的表达可知：与Control组相比，miR-503-5p mimic组E-cadherin表达显著上调，β-catenin和N-cadherin表达显著下调，bFGF组E-cadherin表达显著下调，β-catenin和 N-cadherin表达显著上调，说明过表达miR-503-5p可以抑制膀胱癌细胞T24的上皮-间充质转化，bFGF促进膀胱癌细胞T24的上皮-间充质转化；mimic+bFGF组β-catenin,N-cadherin和E-cadherin的表达，与Control组无显著差异，比miR-503-5p mimic组E-cadherin表达显著下调，β-catenin和N-cadherin表达显著上调，比bFGF组E-cadherin表达显著上调，β-catenin和N-cadherin表达显著下调，这说明过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达进而来抑制膀胱癌细胞T24的上皮-间充质转化(P<0.01,图4)。

2.5裸鼠体内实验 30 d后，检测肿瘤重量可知：miR-503-5p mimic组与Control组相比，肿瘤重量显著减轻，说明miR-503-5p过表达可以抑制膀胱癌细胞T24的发生和发展(P<0.01，图5A、B)。

通过RT-PCR检测miR-503-5p和bFGF的表达发现：miR-503-5p mimic组与Control组相比，miR-503-5p的表达量显著上调，bFGF的表达量显著下调，说明miR-503-5p可以使miR-503-5p高表达，抑制bFGF的表达(P<0.01，图5C)。

通过免疫组化检测Ki67和β-catenin发现：与Control组相比，miR-503-5p mimic组Ki67和 β-catenin阳性比率显著减少，说明过表达miR-503-5p 可以抑制膀胱癌细胞T24细胞增殖和上皮-间充质转化(P<0.01，图5D、E)。

3 讨论

miR-503的表达异常与多种癌症的发生和发展有关：Jiang等[9]通过研究发现miR-503表达通过抑制ZNF217表达抑制前列腺癌的发生和发展；Yan等[10]通过研究发现miR-503通过靶向胰岛素样生长因子1受体，抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭；张等[21]发现miR-503通过Notch1信号通路对肺癌迁移和侵袭的影响；李小辉等[4]通过研究发现miR-503-5p通过干扰Rb/E2F信号通路，抑制膀胱癌细胞T24和膀胱癌细胞EJ的增殖。本文通过研究发现：在结肠癌中，miR-503-5p直接靶向作用于bFGF，并且过表达miR-503-5p抑制bFGF表达，可以抑制结肠癌的发生和发展。

肿瘤细胞的侵袭能力强是癌症转移且难以根治的主要原因，miR-503的低表达与肿瘤细胞的侵袭是密切相关的。Wu等[11]通过研究发现miR-503的下调是胃癌细胞更具有侵袭性；Jiang等[12]通过研究发现miR-503下调通过靶向Cyclin D1促进食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭；Wang等[13]研究miR-503通过靶向胰岛素样生长因子1受体抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭。本文通过Transwell检测细胞侵袭情况可知，过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达进而来减弱膀胱癌细胞T24的侵袭能力。

肿瘤细胞迁移速度快是癌症治疗过程中的重要难点，miR-503与肿瘤细胞的迁移是密切相关。Muys等[14]通过研究发现miR-503过表达降低了JEG-3肿瘤细胞株的侵袭和迁移能力；Wu等[15]通过研究发现miR-503通过调节成纤维细胞生长因子2抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移的作用；Zhang等[16]通过研究发现miR-503在胶质母细胞瘤中过表达不仅通过诱导G0/G1细胞周期阻滞和凋亡来抑制细胞增殖，而且抑制癌细胞侵袭和迁移；本文通过划痕实验结果表明过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达来降低膀胱癌细胞T24迁移能力。

上皮-间充质转化是指细胞失去细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，而转变为具有较高迁移与侵袭能力的间质表型。上皮-间充质转化是恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。Zhao等[17]通过研究发现乳腺癌细胞中miR-503-3p可以直接结合上皮-间充质转化相关蛋白SMAD2和上皮标记蛋白E-cadherin的mRNA 3′端的未翻译区，从而抑制乳腺癌细胞上皮-间充质转化。Peng等[18]通过研究发现miR-503抑制胃癌细胞生长和上皮-间充质转化。Guo等[19]通过研究发现miR-503通过靶向c-myb抑制骨肉瘤的上皮-间充质转化和转移。本文通过研究发现，过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达进而来抑制膀胱癌细胞T24的上皮-间充质转化。

通过体外实验可知，过表达miR-503-5p通过抑制bFGF表达进而来抑制膀胱癌细胞T24的侵袭能力、迁移能力和上皮-间充质转化。相比单一的外部环境，生物体内环境是极其复杂多变的，为了更好的了解miR-503对结肠癌的作用，本文进行了裸鼠体内实验。Zhou等[20]通过研究发现miR-503通过靶向FGF2和VEGFA的负调节来抑制肝癌移植小鼠模型中肝癌细胞的增殖。本文通过裸鼠体内实验研究发现，过表达miR-503-5p 通过抑制bFGF表达抑制膀胱癌细胞T24细胞增殖和上皮间质转化，从而抑制膀胱癌细胞T24的发生和发展。

综上所述，无论是在体外还是体内，过表达miR-503-5p 通过靶向抑制bFGF表达抑制膀胱癌细胞T24细胞的侵袭、迁移和上皮-间充质转化，从而抑制膀胱癌细胞T24的发生和发展。这为膀胱癌的治疗和诊断提供新的思路，为miR-503-5p作为膀胱癌基因治疗的靶点提供参考数据。