人眼角膜基质生物力学特性研究△

薛超 向尧齐 王雁 沈岷 吴迪

透明的人眼角膜是眼球壁外层重要的结构，除了提供眼球总屈光力的2/3，它的外形和位置决定了其对眼内容物具有保护作用。疾病、外伤、手术、配戴角膜接触镜等均能够通过改变角膜形状进而影响成像质量。角膜生物力学特性研究有助于角膜扩张症、圆锥角膜等的早期诊断，也有助于评估一些临床治疗的有效性，如角膜屈光性手术、角膜交联术等。此外，角膜生物力学特性研究在眼压测量、青光眼管理等方面也具有重要作用。目前，由于人眼角膜的珍贵性，角膜生物力学的研究多以动物眼、人尸眼或病变角膜(如圆锥角膜)为研究对象，不能准确描述正常人眼角膜组织材料的特性。然而，随着飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(small incision lenticule extraction，SMILE)的出现，使获得正常人眼新鲜角膜基质组织成为可能。

本研究拟通过对SMILE术中取出的角膜基质透镜行单轴拉伸，进行应力-应变实验、蠕变实验、应力松弛实验，得到人眼角膜基质的应力-应变关系曲线、蠕变曲线和应力松弛曲线，从而初步了解人眼角膜基质的生物力学特性。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试件制作对预行SMILE者行严格的术前筛查，包括裸眼视力、裂隙灯显微镜、直接眼底镜、角膜地形图、眼压、验光等，排除标准包括：圆锥角膜或可疑圆锥角膜，活动性的眼部及全身疾病，眼部手术史、外伤史及其他影响角膜健康的疾病。最终纳入45例患者共90只角膜基质透镜，其中男24例，女21例，年龄(21.02±3.74)岁，屈光度(-5.57±1.72)D。

所有手术均由同一位经验丰富的医师完成，SMILE使用VisuMax型飞秒激光器(Carl Zeiss Meditec AG，Jena，德国)完成。手术步骤参见文献[1-3]。本研究经天津市眼科医院伦理委员会审核批准，所有患者均自愿接受手术并签署知情同意书。

SMILE术中取出角膜基质透镜后，用龙胆紫标记12点钟位，然后立即放入角膜保存液(Eusol-C，Alchima，Padova，意大利)中置于4 ℃冰箱中保存，保存时间不超过24 h。角膜基质透镜直径6.5 mm，厚度为(112.27±26.33)μm，具体角膜基质透镜的厚度由每个眼球的屈光度决定。开始实验时，将角膜基质透镜放置于橡胶垫上展平后使用自制双刃刀沿12点钟位垂直剪切为宽度1 mm的角膜基质试件，每个角膜基质透镜裁切后得到1个试件。

1.2 实验方法将试件夹持于夹具上，使用凯尔原位拉压力学试验系统[型号IBTC-50，凯尔测控试验系统(天津)有限公司]进行实验。实验开始时先对试件进行3次预调，迟滞环稳定后正式开始实验。实验在室温下进行，使用生理盐水水浴装置保持试件的湿润。由于部分角膜基质试件在实验过程中有滑脱、撕裂等现象，导致实验结果不完整，分析时将该部分角膜基质试件排除，最终应力-应变实验测试了34条角膜基质试件，蠕变实验测试了11条角膜基质试件，应力松弛实验测试了6条角膜基质试件。因不同角膜基质试件应力-应变实验结果相差较大，而蠕变实验与应力松弛实验不同角膜基质试件间结果相对较为稳定，故应力-应变实验较应力松弛与蠕变实验测试了更多的角膜基质试件。

1.2.1 应力-应变实验角膜基质试件预调稳定后，以0.01 mm·s-1的速度进行单轴拉伸直至试件断裂，记录角膜基质试件的低应变区切线模量(low-strain tangent modulus，LSTM)、高应变区切线模量(high-strain tangent modulus，HSTM)[4]及断裂点的应力和应变，同时记录0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa时角膜基质试件的弹性模量。

1.2.2 蠕变实验角膜基质试件预调稳定后，以0.02 N·s-1的速度拉伸到1.00 N，维持此载荷不变，持续观察600 s，以了解角膜基质的蠕变情况。

1.2.3 应力松弛实验角膜基质试件预调稳定后，以0.02 mm·s-1的速度拉伸至初始长度的1.5倍，维持此长度不变持续观察1 h，以了解角膜基质的应力松弛情况。

2 结果

2.1 角膜基质试件预调图1显示了角膜基质试件的预调载荷-位移曲线，可以看出，随着循环次数的增加，滞后环逐渐减小，经过3次循环后，载荷-位移曲线稳定，加载-卸载曲线接近可逆，此时可认为角膜内部能量损耗趋于零，故认为预调3次已能达到实验要求。

图1 角膜基质试件的预调载荷-位移曲线

2.2 应力-应变实验图2显示了典型的角膜基质试件应力-应变曲线，该曲线由四段组成，第一段OA段为正常生理作用范围，载荷变化很小而变形迅速增大，OA段可以看作线弹性区；AB间呈非线性关系，随着变形增大，载荷呈指数关系增加；第三段BC段近似为一直线；最后阶段CD段，载荷与变形之间呈非线性关系；到D点时，材料被拉断。将OA段及BC段的弹性模量分别视为LSTM、HSTM。LSTM、HSTM及断裂点D的应力及应变被用来表征角膜基质的生物力学特性。

本实验测试了34条角膜基质试件，LSTM为(1.32±0.48)MPa，HSTM为(51.26±8.23)MPa，断裂点应变为(0.52±0.06)mm·mm-1，断裂点应力为(13.00±2.51)MPa。在应力为0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa时，角膜基质试件弹性模量分别为(0.89±0.25)MPa、(1.28±0.21)MPa、(1.69±0.18)MPa。生理状态下角膜的弹性模量与应力呈线性正相关。

LSTM与等效球镜度数、角膜基质透镜厚度存在显著相关性(r=0.340、-0.387，均为P<0.05)，与性别、年龄、中央角膜厚度均无显著相关性(均为P>0.05)；HSTM同样与等效球镜度数、角膜基质透镜厚度存在显著相关性(r=-0.358、0.379，均为P<0.05)，与性别、年龄、中央角膜厚度均无显著相关性(均为P>0.05)。

图2 角膜基质试件的应力-应变曲线

2.3 蠕变实验本实验测试了11条角膜基质试件，其蠕变曲线见图3，在1.00 N恒定载荷下持续观察600 s，角膜基质试件形变随时间延长而增大，早期变化较快，后期逐渐变缓，600 s时蠕变率为(4.57±1.67)%。由图3可以看出，11条角膜基质试件的蠕变曲线相对较为一致。

图3 角膜基质试件的蠕变曲线

2.4 应力松弛实验本实验测试了6条角膜基质试件，其应力松弛曲线见图4。应力随着时间的延长逐渐衰减，早期衰减较快，随着时间的延长衰减趋于平缓，1 h时松弛率为(28.49±0.04)%。由图4可以看出，6条角膜基质试件的应力松弛曲线趋势也较为一致。

图4 角膜基质试件的应力松弛曲线

3 讨论

透明的人角膜是眼球壁外层重要的结构，其具有独特的生物力学特性[5-7]以保护眼球组织。角膜的生物力学被定义为在承受外界压力时如何反应和变形[8]，其与眼科的许多疾病以及角膜屈光性手术均密切相关[9]，测量角膜的生物力学特性有助于角膜扩张症及圆锥角膜等的早期诊断[10]，可用于角膜屈光手术、角膜交联术乃至角膜接触镜的配戴等各种临床治疗有效性的评估。有研究表明，角膜生物力学特性对角膜屈光手术的最终结果和可预测性至关重要[11-12]。Roberts等[13]研究表明，角膜屈光手术后继发性角膜扩张症最早的变化源于角膜生物力学特性的改变。近年来角膜生物力学特性的研究已成为热点[14]。

由于角膜主要由致密排列于基质板层间的胶原纤维和细胞外基质组成，而基质层占角膜总厚度的90%，其胶原纤维成分和纤维结构决定了最主要的角膜生物力学性能[15-17]。因此，对角膜基质部分生物力学特性的研究有助于了解整个角膜的生物力学特性。作为典型的软组织材料，角膜本身具有非线弹性。因角膜基质含有大量的水分，决定了角膜具有黏弹性，主要包括黏滞性、蠕变和应力松弛[18]。本研究使用SMILE术中取出的新鲜的角膜基质透镜进行应力-应变实验、蠕变实验、应力松弛实验，目的是对人眼角膜基质的生物力学特性有一初步了解。

本研究中，为保证实验的准确性，在获取角膜基质透镜并标记后，立即放入Eusol-C角膜保存液中进行保存。以往的研究[19-20]显示，该保存液可以在1周内有效地保持角膜基质的水合状态。本研究中角膜基质透镜在角膜保存液中不超过24 h，在此期间即进行实验，所以实验时基本能够保证角膜基质试件维持在其生理状态，保证实验结果的准确性。

弹性模量是重要的生物力学参数，以往对人角膜弹性模量的报道差异较大[19，21-25]，从0.159 MPa[19]到57 MPa[26]不等。Glass等[21]认为，这与角膜微结构复杂，尸眼角膜水肿、泪膜消失、角膜不再透明有关，此外，温度的改变及组织降解也会导致角膜生物力学特性的改变。由于角膜是黏弹性材料，不同的加载速率也会影响测得的弹性模量的大小。本研究中获得的LSTM为(1.32±0.48)MPa，HSTM为(51.26±8.23)MPa，断裂点应变为(0.52±0.06)mm·mm-1，断裂点应力为(13.00±2.51)MPa，这是首次报道人眼新鲜角膜的弹性模量及断裂点的应力、应变数值。同之前的基于尸眼或病变角膜的研究相比，本研究LSTM和HSTM均相对较高。其原因可能有：(1)之前的研究是基于尸眼或病变角膜，有可能由于组织的分解导致生物力学特性的改变。(2)有研究[27-28]显示，角膜上皮层和后弹力层对角膜生物力学贡献较小。Labate等[29]基于人尸眼的研究显示，人眼角膜基质弹性模量从前向后逐渐变小，前基质层弹性模量最大。可以推断，对于同样厚度的角膜基质试件，前基质层较全层角膜组织生物力学性能更好。所以本研究中来自前基质层的角膜基质透镜较之前来自全层角膜厚度的试件生物力学性能更好，弹性模量可能较高，这也从实验角度印证了这一特性。

本研究中，LSTM 相对HSTM明显较小，这是因为角膜是典型的软组织材料，具有非线弹性的特性，其切线模量随应力的增大而增大[30]。本研究结果显示，生理状态下，(即应力为0.01 MPa、0.02 MPa、0.03 MPa对应的状态[31])角膜的弹性模量与应力呈线性正相关。

蠕变是指将试件突加一定的应力，然后此应力保持常数，而试件继续发生变形的现象。本实验测试了11条角膜基质试件，在1.00 N恒定载荷下持续观察600 s，由蠕变曲线可以看出，角膜基质试件形变随时间延长而增大，早期变化较快，后期逐渐变缓，600 s时蠕变率为(4.57±1.67)%。将试件突加一定应变，然后保持此应变量，应力逐渐减少的过程称为应力松弛。本实验测试了6条角膜基质试件，角膜基质试件预调稳定后，以0.02 mm·s-1的速度拉伸至初始长度的1.5倍，维持此长度不变持续观察1 h，1 h时松弛率为(28.49±0.04)%。杨坚等[32]使用角膜移植手术后剩余的周边角膜进行了实验，结果显示，300 s内伸长比开始时蠕变增加了0.7%；保持初长度为原长度的1.3倍不变，计算出松弛率为14.4%。这可能是由于角膜边缘与巩膜相连，胶原纤维排列比较致密，从而使得角膜边缘组织具有较强的蠕变性和松弛性[33]。本研究发现，不同人眼角膜基质试件蠕变曲线相对较为集中，应力松弛曲线趋势也较为一致，故只进行了少数角膜基质试件的测试，后面的研究尚需进一步扩大样本量。

综上所述，本研究首次使用新鲜的角膜基质透镜得出了正常角膜基质组织的生物力学特性，初步得到人眼角膜基质的应力-应变曲线、蠕变曲线和应力松弛曲线，给出了LSTM、HSTM及生理状态的弹性模量。由于角膜组织的生物力学特性相对复杂，而临床意义重大，本研究或许为难以获得的角膜实验材料提供新的研究途径和新思路，希望能够为深入角膜生物力学特性的临床和基础研究提供一定的理论基础。