大豆分离蛋白对肌原纤维蛋白加热过程中结构及流变特性的影响

朱佳倩 张顺亮 赵冰 宋永青 李克勖 魏江飞 丁炳文 周湘媛 邓静 李美良

摘 要：大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）作为优质的植物蛋白常被用于肉制品加工中，以提高产品产量和质地。研究添加SPI对肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）凝胶特性及MP加热过程中结构和流变特性的影响。结果表明：添加10%、20% SPI能提升混合凝胶的凝胶强度及保水性（P<0.05）;加热过程中混合蛋白凝胶二级结构发生改变，但其变化规律尚不明确;添加SPI使混合凝胶儲能模量及损耗模量下降;混合凝胶上清液十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示，肌球蛋白重链、肌动蛋白、SPI部分亚基均是参与凝胶形成的蛋白质。

关键词：肌原纤维蛋白;大豆分离蛋白;加热过程;结构;流变特性

Abstract： As a high-quality plant protein， soybean protein isolate （SPI） is often used in meat processing to improve product yield and texture. This study researched the effect of SPI addition on the gelation properties of myofibrillar protein （MP） and its secondary structure and rheological properties during heating. Results indicated that adding 10% or 20% SPI could improve the gel strength and water-holding capacity of MP gel （P < 0.05）; the secondary structure of mixed gels was changed during heating， but no regular pattern was found; the storage modulus and loss modulus were decreased by adding SPI. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of mixed gel supernatants showed that myosin heavy chain， actin and some subunits of SPI were involved in gel formation.

Keywords： myofibrillar protein; soybean protein isolate; heating; structure; rheological properties

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190802-170

中图分类号：TS201.1                                      文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）09-0001-07

引文格式：

朱佳倩， 张顺亮， 赵冰， 等. 大豆分离蛋白对肌原纤维蛋白加热过程中结构及流变特性的影响[J]. 肉类研究， 2019， 33（9）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190802-170.    http：//www.rlyj.net.cn

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肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）是肌肉蛋白的重要组成部分，在乳化肉制品中发挥着重要作用，它具有良好的凝胶能力和水结合能力，影响着肉制品的凝胶性能和流变性能[1-2]。在肉制品生产加工过程中，为改善产品质地、风味，常加入非肉类蛋白质，如大豆蛋白、豌豆蛋白和蛋清蛋白[3]。大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）作为优质的植物蛋白，有着许多优良的功能特性，如持水性、凝胶性，因此常作为添加剂应用于肉制品中[4]。Herrero等[5]研究表明，在肉制品生产中加入SPI不仅能提高产品产量，还可以显著提高肉制品的质地。在肉制品中加入SPI不仅可以降低成本，丰富蛋白质种类，还能获得更健康的效应，已成为肉制品加工，特别是乳化香肠加工的新方向[6-7]。

加热是肉制品加工中的重要工序，而在加热过程中蛋白质会发生许多复杂变化。蛋白质受热变性展开折叠，变性蛋白与其他蛋白质分子有序聚集，形成三维网状结构，多聚体之间和多聚体-溶剂引力、斥力之间相互平衡，最终形成有序的网络结构，而在此过程中MP发挥着重要作用[8-9]。孔保华等[10]研究表明，猪肉MP凝胶经70～80 ℃热处理后其保水性较好。李清正等[11]发现，猪肉MP与鱼肉MP质量比1∶1复合的蛋白凝胶特性更优。

Xu Lianxu等[12]研究猪肉MP加热过程中的二级结构变化，发现随着温度的升高，α-螺旋含量下降，β-折叠含量升高，与Liu Ru等[13]研究得到的鱼肉肌球蛋白二级结构变化规律一致。目前，关于SPI对MP加热过程中结构的影响研究较少。

本研究通过添加不同量SPI，测定混合蛋白凝胶的质地及流变特性，研究SPI对MP凝胶特性、流变学特性的影响，探究SPI对MP凝胶加热过程中结构的影响，为SPI应用于乳化香肠的加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉（里脊肉） 四川省雅安市雨城区佳享食品;大豆分离蛋白 山松生物制品有限公司。

BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型） 碧云天生物技术有限公司;凝胶配制试剂盒 武汉博士德生物工程有限公司;其他试剂均为分析纯 成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

CSRH300实验室均质机 驰勒（上海）机械科技有限公司;TGL 16M高速冷冻离心机 长沙湘智仪器有限公司;PHS-3C+酸度计 成都方舟科技有限公司;HH-601恒温数显水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;Varioskan flash全波长酶标仪、Nicolet is10傅里叶变换红外光谱仪 赛默飞世尔科技公司;Scientz-12N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;TA-XT Plus物性分析仪、DHR-3流变仪 美国TA公司;CS-10色差仪 杭州彩谱科技有限公司;Mini Protein 3垂直电泳仪、Dio-Gel-2000凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司;TS-2000A脱色摇床 海门市麒麟医用仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

参考Xiong YoulingL.[14]的方法并略作改动。将猪里脊肉剔去脂肪和结缔组织，切碎后备用。取肉丁加入5 倍体积10 mmol/L磷酸盐缓冲液（含0.1 mol/L NaCl、2 mmol/LMgCl2、1 mmol/L乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA））均质后4 ℃、8 000 r/min离心15 min，弃上清;采用相同的均质和离心条件，用5 倍体积缓冲液洗涤沉淀2 次;所得沉淀用5 倍体积0.1 mol/L NaCl在相同条件下洗涤蛋白沉淀3 次，最后1 次离心前用4 层纱布过滤，并用0.1 mol/L HCl调整pH值到6.0，所得沉淀即为MP。提取的MP用烧杯于4 ℃冷藏，48 h内用完。

1.3.2 蛋白质质量浓度测定

将MP溶于含0.6 mol/L NaCl（pH 6.25）的50 mmol/L磷酸盐缓冲液中（稀释至约0.4 mg/mL），采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定MP质量浓度。

1.3.3 MP及混合凝胶的制备

将提取的MP悬浮于含0.6 mol/L NaCl（pH 6.25）的50 mmol/L磷酸盐缓冲液中，并将SPI按比例添加，使其与MP质量比分别为0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6，即SPI添加质量分数分别为0%、10%、20%、30%、40%，最终混合溶液中蛋白质质量浓度为40 mg/mL。随后将混合溶液均质，使其混合均匀。将混合后的溶液置于玻璃烧杯（25 mm×40 mm）中，80 ℃水浴加热30 min，冷却备用。

1.3.4 凝胶强度测定

测试时将样品置于测试台中心，于室温条件下进行测定。选择P/5S探头，采用穿刺模式，穿刺距离12 mm，测试速率0.5 mm/s，触发力5 g，测试凝胶的破断力和凹陷深度。每组样品重复测定3 次，取平均值。按式（1）计算凝胶强度。

1.3.5 凝胶保水性测定

参考Salvador等[15]的方法并稍作改动。称取5 g凝胶，在4 ℃、10 000 ×g条件下离心10 min，记录离心前后离心管中凝胶的质量。每组样品进行3 个重复，凝胶保水性按式（2）计算。

1.3.6 凝胶白度测定

参考Park[16]的方法，测定凝胶的亮度值（L*）、红度值（a*）和黄度值（b*）。仪器用标准白色反射板校准。按式（3）计算白度。每个样本重复测定6 次，取平均值。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱分析

将制备的蛋白混合溶液（质量浓度40 mg/mL）分别放入30、40、50、60、70、80、90 ℃热水中水浴加热30 min，以未加热（20 ℃）样品为对照。加热完成后冷冻干燥，取上述冻干样品与干燥的溴化钾按质量比1∶100充分研磨后压片，用傅里叶变换红外光谱仪测定，分辨率4 cm-1，扫描32 次，扫描范围4 000～400 cm-1。

1.3.8 凝膠流变特性测定

参考Niu Haili等[17]的方法并稍作改动。使用流变仪测定凝胶加热过程中的流变特性。流变仪配置2 个直径40 mm、间距1 mm的平行板。将质量浓度20 mg/mL的蛋白试样从20 ℃加热到80 ℃，升温速率2 ℃/min。每个试样以振荡模式连续剪切，频率固定为0.1 Hz，最大应变为0.02%，选择非迭代采点。记录凝胶的储能模量（G）、损耗模量（G）和损耗因子（tanδ），以表征凝胶的流变特性。在测定过程中，为防止样品水分蒸发，在样品边缘涂抹硅油。

1.3.9 凝胶形成蛋白的鉴定

将制备的质量浓度40 mg/mL混合蛋白溶液分别放入50、60、70、80、90 ℃热水中水浴加热30 min，加热完成后冷却备用。以未加热的混合蛋白溶液为对照。参考Niu Haili等[17]的方法，取5 g蛋白凝胶，4 ℃、10 000×g离心10 min，取上清液加入等体积pH 6.8的上样还原缓冲液，缓冲液含0.7 mol/L十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、0.5 mol/L Tris-HCl、体积分数10% β-巯基乙醇、1.5 mmol/L溴酚蓝和体积分数20%甘油。将混合物在沸水中加热5 min，使蛋白质完全溶解，冷却后放入微量离心管中，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以5%聚丙烯酰胺浓缩胶和12%聚丙烯酰胺分离胶检测未形成凝胶的蛋白。

1.4 数据处理

所得数据均为重复实验结果，结果表示为平均值±标准差。采用SPSS 19软件进行数据统计分析。用最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）进行显著性分析（P<0.05），采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 SPI对MP凝胶强度的影响

小写字母不同，表示差异显著（P<0.05）。图2～3同。

由图1可知：对照组（SPI添加量0%，下同）MP凝胶强度为560.42 g·mm，加入一定量SPI能显著提高MP凝胶强度，而SPI添加量继续增加将导致MP凝胶强度下降;当SPI添加量为10%、20%时，MP凝胶强度显著增大（P<0.05），出现这种现象可能是在SPI添加量较低时，SPI均匀分散在凝胶网络中充分吸水，形成较为坚固的凝胶网络结构，使得MP凝胶强度增大;与对照组相比，添加30%、40% SPI的MP凝胶强度显著减小（P<0.05），这可能是由于SPI添加量增多，MP分子形成凝胶网络结构时的阻力增大，2 种蛋白质的自身相互作用增强，形成单独的相会导致凝胶结构脆弱，混合蛋白凝胶强度下降[18-19]。肌球蛋白是MP中含量最多的蛋白质，在肌球蛋白热诱导凝胶形成过程中，头部区域通过二硫键进行聚合，尾部区域则受热展开形成网络结构。在一般的热加工条件下，SPI结构基本不发生变化，因此混合凝胶中肌球蛋白与SPI相互作用较弱[20]。Peng等[21]的研究也表明，在MP凝胶形成过程中，天然大豆球蛋白可能不会与肌球蛋白发生相互作用。

2.2 SPI对MP凝胶保水性和白度的影响

保水性表示蛋白质结合水的能力，是蛋白凝胶体系最重要的功能特性之一，通常用于评估肉类及其产品的质量和产量[22-23]。

由图2可知，对照组MP凝胶保水性为74.81%，SPI添加量为10%、20%时，MP凝胶保水性显著增加（P<0.05）。适量添加SPI时，分子间疏水相互作用适度增强，促进凝胶基质的形成，使更多的水分子被束缚在凝胶中[24]。SPI添加量为40%时，MP凝胶保水性最低，这是由于SPI过量添加增强了2 种蛋白质的疏水相互作用，凝胶网络束缚水分子的能力降低，在离心条件下水分子更容易游离出来[25]。保水性与凝胶强度测定结果的相似性说明，致密的凝胶网络结构不仅能提高凝胶的强度还能增加其保水性。

由图3可知，对照组MP凝胶白度最大，为85.13，混合凝胶的白度随SPI添加量的增大显著降低（P<0.05）。推测是由于SPI本身为黄色且其在加热过程中较为稳定，不会发生褪色或变色现象，对混合凝胶的整体颜色影响较大，因而SPI添加量越大，混合凝胶的白度越低。

2.3 SPI对MP凝胶加热过程中结构的影响

蛋白质的红外吸收光谱由多个吸收带组成，酰胺Ⅰ带源于C=O伸缩振动，出现在1 600～1 700 cm-1。酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带分别出现在1 510～1 570、1 200～1 335 cm-1处，是由于C-N伸缩振动和N-H变形振动偶合造成的[26]。A～E. SPI添加量分别为0%、10%、20%、30%、40%。

由图4可知，所有样品在3 414、1 637、1 536、1 238 cm-1存在特征吸收峰，且随着处理温度的升高，特征峰位置基本不变。未添加SPI时，对照（20 ℃）样品由于蛋白质及多肽链的吸收，于1 619 cm-1处出现吸收峰。当处理温度升至60 ℃，1 619 cm-1处吸收峰消失，且1 637 cm-1处吸收峰变宽且峰形向高波数方向扩展，说明蛋白质在加热过程中结构已发生明显变化。对未添加SPI的对照（20 ℃）处理样品酰胺Ⅰ带图谱进行去卷积或二阶导数处理并进行曲线拟合，发现其中含α-螺旋21.04%、无规则卷曲21.90%、β-转角36.33%、β-折叠20.73%;90 ℃处理后，α-螺旋和无规则卷曲含量分别减少至17.78%和8.86%，而β-转角、β-折叠含量上升，分别为49.00%、24.36%。说明加热过程中α-螺旋含量减少，β-折叠和β-转角含量逐渐增多。李清正等[27]研究表明，随温度升高，MP的β-折疊含量升高，α-螺旋和无规则卷曲含量下降。

α-螺旋含量降低表明，在加热过程中蛋白质分子展开随后相互交联，分子聚集体增加，导致β-折叠含量升高[28]。

当SPI添加量逐渐增加，样品在加热过程中，蛋白红外吸收峰位置基本不变，峰形变化不明显。对其酰胺Ⅰ带图谱进行去卷积或二阶导数处理，发现特征吸收子峰在加热过程中随着SPI添加量的增多反而逐渐减弱。

这可能是由于天然SPI结构稳定，在加热过程中其中的β-伴球蛋白对肌球蛋白重链的自聚集产生阻碍作用[29];其次SPI的二级结构以β-折叠为主，经过加热处理后，α-螺旋含量增加，β-折叠含量降低[30-31];而MP在加热过程中二级结构变化趋势与此相反，故未能在SPI和MP的混合蛋白样品加热过程中观察到规律性变化。

2.4 SPI对MP凝胶流变特性的影响

由图5可知，SPI添加量对MP凝胶G总体变化趋势影响不大。MP凝胶G在初始阶段（20～40 ℃）变化缓慢，这是由于在此阶段蛋白质的相互作用比较弱;随后MP凝胶G随温度上升迅速升高，并在52 ℃左右达到最大值，说明此时大多数肌球蛋白分子已经展开，并相互交联结合，蛋白质聚集体之间交联增多[24，32];所有样品达到峰值的温度均在52 ℃左右，说明SPI的添加对蛋白变性温度基本没有影响，然而该温度下混合凝胶G却明显低于对照组，说明SPI添加量与混合凝胶G呈负相关。

杜洪振等[25]认为，SPI中的β-伴球蛋白减少了50～80 ℃加热期间肌球蛋白重链的自聚集，从而干扰MP凝胶网络的形成。Amiri等[33]认为，G代表凝胶的硬度，而凝胶硬度受蛋白质质量浓度、结合能量和蛋白质反应链相互作用程度的影响。SPI的添加减小了MP质量浓度，阻碍了肌球蛋白之间的相互作用，进而使得G减小。随着温度的继续升高，凝胶G迅速下降，在达到60 ℃后又开始逐步回升。说明预凝胶状态已经形成，蛋白质结构进一步改变，暴露出更多反应基团和反应侧链[34]。而G的持续升高则说明不可逆的肌球蛋白丝或复合物已形成[3]。

由图6可知，与G结果相似，对照组MP凝胶的G最高，添加10%和20% SPI的凝胶次之，添加40% SPI的凝胶G最低。所有凝胶样品G均在52 ℃左右达到峰值，随后迅速下降并趋于平稳。

tanδ是G与G的比值，也能反应样品流变特性的变化。由图7可知，MP凝胶tanδ始终小于1，说明样品弹性大于黏性，为溶胶或凝胶。在20～40 ℃范围内，添10%、20% SPI的凝胶tanδ与对照组差别较小，而添加30%、40% SPI的样品tanδ更高，说明该添加量下的凝胶在初期阶段具有更好的黏性;在40～45 ℃温度范围内，凝胶tanδ均有一定增加，说明黏性蛋白质溶胶转变为弹性半固体[35]。在达到第1个峰值后，样品tanδ迅速下降，在52 ℃左右达到第2个峰值。随后tanδ继续下降，最后趋于平稳，这表明蛋白质分子构象进一步改变，形成不可逆的热凝胶[36]。

2.5 MP凝胶形成蛋白的鉴定

离心能有效去除混合凝胶中未参与凝胶形成的蛋白，离心后上清液中结合力弱的蛋白质可以通过SDS-PAGE被鉴定。由图8A可知，未加热MP凝胶上清液中存在肌球蛋白重链（200 kDa）、肌动蛋白（43 kDa）和原肌球蛋白（34 kDa），50 ℃加热处理的样品中均能检测到上述3 种蛋白，而60 ℃加热处理的样品中只检测到肌动蛋白和原肌球蛋白。随着处理温度的升高，肌球蛋白重链、肌动蛋白消失，这说明2 种蛋白质参与凝胶网络结构的形成。而原肌球蛋白在各温度组的上清液中均被检测到，说明它不参与凝胶网络的形成。

加入SPI后，不同溫度加热处理组的上清液中也出现部分SPI亚基的条带，且条带颜色随着SPI添加量的增加而加深，说明SPI中只有部分亚基参与了凝胶的合成，过多的SPI阻碍了凝胶网络结构的形成，使混合蛋白凝胶强度下降。由图8B可知，50 ℃加热处理的上清液中存在α、α、β、A3、A和B亚基，当处理温度升高，β、B亚基消失，α、α亚基条带颜色逐渐变浅，说明β、B、α、α亚基均参与凝胶的形成。随着SPI添加量的增加，α、α亚基的条带在其他温度处理下均可见，且条带颜色随着SPI添加量的增加而加深。说明α、α亚基只有部分参与到凝胶形成过程中。而β、B亚基仅在50、60 ℃加热处理的上清液中出现，在其他温度加热处理下均未见条带，说明2 种亚基均参与混合蛋白凝胶的形成。Jiang Jiang等[37]的研究也表明，在混合凝胶形成中，仅有某些特定的大豆多肽是凝胶构成的显著要素。

3 结 论

通过添加不同量SPI，研究其对MP凝胶特性及混合凝胶加热过程中结构和流变特性的影响。结果表明：添加10%、20%的SPI可提高MP凝胶的凝胶强度和保水性;傅里叶变换红外光谱研究显示，加热后MP中α-螺旋和无规则卷曲含量下降，β-折叠、β-转角含量升高，混合蛋白凝胶二级结构变化规律尚不明确;添加不同量SPI对蛋白质变性温度并无影响;SDS-PAGE结果表明，SPI成分中仅部分亚基是构成凝胶结构的重要因素。综上所述，添加较低量SPI代替肉蛋白对乳化香肠质构有改善作用。在肉制品实际生产中少量添加SPI不仅能控制成本，更可以达到丰富产品中蛋白质种类的目的。

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