某规模化猪场类NADC30 、HP-PRRSV、PRRSV 与大肠杆菌混合感染的诊断与防治

申欢欢，阳爱国，陈弟师，颜其贵

（四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)也称猪蓝耳病，是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种严重的病毒性传染病。该病以引起母猪的繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征[1，2]。本病曾经在欧洲的德国、荷兰、西班牙、比利时、英国、法国，美洲的墨西哥、智利，亚洲的韩国、日本都发生过，仅美国2005-2010 年PRRS 就 造 成 了6.64 亿美元的损失，严重危害世界养猪业的发展[3，4]。在中国，由于对该病的认识和防控不到位，病毒与猪体之间的相互作用促进了病毒变异，导致了自2006 年以来暴发高致病性蓝耳病（HPPRRSV），HP-PRRSV 的NSP2 区出现30 个AA 缺失，gp5 区域也发生了变异，对中国养猪业造成很大损失，但是有研究表明NSP2 区域的缺失并不是猪高致病性蓝耳病毒力增强的根本原因[5，6]；自2013 年起我国出现变异株NADC30-like-PRRSV(NADC30)，NADC30 NSP2 区 域 出 现131 个AA缺失，gp5 区域也发生了变异[7,8]，进一步加重了PRRSV 的危害，该病有可能为输入性疾病[9，10]。NADC30 毒株与高致病性蓝耳病毒株和普通蓝耳病相比，在基因组学和临床致病性等方面均呈现出明显差异，揭示了我国PRRSV 流行毒株出现了新的变异类型，更加加重了PRRSV 的危害[11]。

1 发病情况

猪场有繁殖母猪1 000 余头，分别于2017 年9 月份和12 月份出现一定量的母猪流产。流产前几天母猪体温升高，食欲减退或不食，部分母猪有呼吸症状，腹部和耳部发绀，流产胎儿多数为死胎，胎儿大小一致无木乃伊胎，少数活仔猪大部分于6 d 内死亡。

2 病理解剖

病理解剖可见仔猪颌下淋巴结，腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结肿大有出血，心包有积液，心冠变软，肺部组织实质性肉变，肺部病例切片显示为典型间质性肺炎（图1）。挤压肺部切面会出现泡沫，肾脏有出血点。

3 实验室检测

3.1 PCR 检测

根据发病情况和免疫程序首先考虑对猪场病料进行猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的检测。应用Primer 5.0探针对NADC30(GenBank: KP860909.1)，JAX1（GenBank:EF112445.1）和CH-1a（GenBank:EF112445.1）为参考序列设计可同时鉴别NADC30，HP-PRRSV和PRRSV的引物PRRSV-F/R，PRRSV目的条带约1 020 bp；HP-PRRSV目的条带约940 bp；NADC30目的条带约6 3 0 b p（P R R S V-F：TTTTGGACACCTCCTTTGATTG；PRRSV-R：TCTACGCTTGACAGG GAGCTGCTT）。PRV的检测使用国标引物PRV-F/R，目的条带约220 bp（PRV-F: CAGGAGGACGAG CTGGGGCT; PRV-R: GTCCACGCC CCGCTTGAAGCT）。取疑似发病猪只心，肝脏，脾，肺和肾等组织做匀浆处理；12 000 r/min离心5 min收集匀浆上清液；参照美基生物病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书提取病料DNA/RNA，50 μL Nuclease free water 溶解核酸。取1 μL核酸参照TAKALA反转录试剂盒说明书反转录为CDNA。PRRSV 10 μL检测体系：0.5 μL CDNA, 10 nmol/L上下游引物各1 μL，7.5 μL Nuclease free water。扩增条件为：98 ℃ 2 min, 98 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s（35循环），72 ℃ 5 min。PCR产物5 μL用 1%琼脂糖凝胶进行鉴定（图2）。PRV 10 μL检测体系：0.5 μL DNA,10 n mol/L上下游引物各1 μL，7.5 μL Nuclease free water。扩增条件为：98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,56 ℃ 15 s, 72 ℃ 10 s（35循环），72 ℃ 5 min。PCR产物5 μL用 1%琼脂糖凝胶进行鉴定。

3.2 细菌检测

3.2.1 细菌分离鉴定

无菌操作取发病猪心、肝、肾、脾等组织接种于含5%胎牛血清的胰蛋白大豆琼脂（TSA）培养基，37 ℃培养36 h 可见直径为1.5 mm 的圆形，光滑，表面湿润，银灰色的菌落。挑取单个菌落进行革兰氏染色和油镜下观察，细菌形态为短杆菌，长约1 ～3 μm(图3)。对分离细菌进行生化鉴定：分离细菌对硫化氢、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、黏液酸（盐）、赖氨酸、鸟氨酸等反应管呈阳性，吲哚试验呈阳性；VP 试验阴性和枸橼酸盐利用呈阴性。生化鉴定结果符合大肠杆菌的特征[12]。

图1 肺部病理切片

图2 PRRSV 检测

图3 细菌镜检

4 分析讨论

通过流行病学、剖检结果和PCR 检测可以初步判定该猪场为PRRSV、HP-PRRSV、NADC30 混合感染。该猪场24 个月前免疫过HPPRRS 疫苗，但是母猪流产情况并没有得到很大的改善。也有报道免疫PRRS 后导致猪群感染PRRSV，这也是许多猪场做PRRS 免疫时的忧虑[13]。该规模化猪场发病猪体表发红，有的出现体温升高的情况；母猪流产胎儿大小差异不大，无木乃伊胎；剖检可见淋巴结肿大有出血，肺部呈现典型间质性肺炎；肾脏有出血点；心包有积液但无纤维渗出。综合以上情况初步判定可能会存在PRRSV 的感染。根据该猪场和NADC30 流行情况运用Primer 5.0 设计可同时扩增PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 引物；PCR 结果出现3 条带大小分别为：1 020 bp、940 bp、620 bp。针对母猪流产情况研究室检测了PRV 和PRRSV。检测结果证实此规模化猪场存在PRRSV 、HPPRRSV、NADC30 混合感染，无PRV的感染。实验室脏器细菌检测结果显示为大肠杆菌感染。该规模化猪场小规模流产诊断为：以PRRSV 、HP-PRRSV、NADC30 混合感染为主因所导致。

5 防治

针对病死猪深埋无害化处理，对猪场进行全面消毒，生活区与生产区分开，进入生产区前要洗澡换鞋，每栋猪舍前放置消毒烧碱水，尽量减少非必要人员和物料接触。对引进后备猪进行隔离检疫；对患病猪只进行隔离并检测猪体情况，进行带猪消毒；猪舍用消毒液消毒每周两次常态化进行；加强猪舍通风和科学饲养管理；优化免疫程序并监测猪群整体状态；及时淘汰老弱母猪。仔猪哺乳前用0.1%的高锰酸钾擦洗母猪腹部；注意仔猪保温和清洁。针对大肠杆菌感染于分娩前2 d 注射氧氟沙星预防处理；每天早晚各1 次。保持哺乳舍的干燥和清洁，保证仔猪保温和干燥，可以提供保温箱或者电热毯。