结核病诊断性血清学特异抗原的筛选和鉴定

杨双 郭婧玮 胡一敏 谭云洪 谭笑 袁仕善

目前，用于结核病诊断的分子生物学技术因敏感度和特异度较高，受到世界卫生组织的推荐[1]。张培泽等[2]研究发现，新一代超敏全自动巢式实时聚合酶链式反应(PCR)技术是目前诊断结核性脑膜炎敏感度较高的方法，但该方法成本昂贵，限制了其在贫困地区的广泛使用。实验室血清学检测具有简便、快速的特点，以结核分枝杆菌抗原包被载体的胶体金法已经作为常规实验室血清学检测方法用来辅助诊断结核病，但目前仍然没有筛选和确定能完全满足结核病血清学诊断需求的抗原种类，还需要大量基础研究进行论证。当前研究较多的结核分枝杆菌抗原主要包括培养滤液蛋白10(CFP-10)、早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)、Ag85A、Ag85B、相对分子质量38 000(38 kDa)抗原、MPT64、热休克蛋白(heat shock protein， Hsp)16.3等[3-6]。免疫共沉淀是一种广泛应用于研究蛋白质间相互作用的经典技术，但较少用于结核病抗原抗体的相互作用和筛选，本研究采用免疫共沉淀和串联质谱技术筛选和鉴定结核分枝杆菌的血清学抗原，以期为结核病的血清学诊断提供依据。

材料和方法

一、材料与试剂

收集2013年2—7月湖南省结核病防治所确诊的首次入院的初治结核病患者，达到30例后停止纳入，收集其血清，作为研究材料；患者纳入标准为病程记录未提示耐药，涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养、结核分枝杆菌抗体检测均为阳性。收集2013年7月湖南省人民医院检验科接收的健康体检者，达到20例后停止纳入，收集其血清，用于做血清学抗原免疫印迹(Western blot，WB)分析时进行对照；纳入标准为，经X线摄影、血红细胞沉降率试验、血常规等体检项目检查，结果均为正常，且无任何临床症状。

结核分枝杆菌标准株H37Rv由湖南省结核病防治所检验科提供；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自湖南艾佳生物科技股份有限公司；免疫共沉淀试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国Bio-Rad公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人免疫球蛋白G(IgG)购自美国Pierce公司；预染蛋白质相对分子质量标准和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

二、方法

1. 结核阳性血清IgG的提取：从收集的结核病患者血清中采用随机数字表抽样法抽取20份(例)提取血清IgG筛选抗原[另外10份(例)血清用于WB验证筛选的抗原能否被此10例混合血清特异性识别]血清各200 μl，混匀后用饱和硫酸铵分级沉淀法提取血清IgG，以磷酸盐缓冲液(PBS)进行透析，去除铵离子(NH4+)，-20 ℃冻存备用。

2. 结核分枝杆菌H37Rv标准株菌体抗原的制备：批量接种结核分枝杆菌标准菌株于改良罗氏培养基，37 ℃培养4周。通过接种环刮取菜花状菌落于丙酮溶液脱脂。加入灭菌PBS重悬菌体，85 ℃水浴30 min，灭菌。反复冻融6次，冰浴超声，以12 000×g高速离心30 min，收集上清，制备菌体抗原。BCA法测定抗体及粗制抗原浓度。

3. 抗体IgG与琼脂糖蛋白A/G的交联：轻摇琼脂糖瓶使琼脂糖悬浮，加于微型柱中，通过柱平衡液洗涤。取10 μg上述提取的20份(例)结核病患者混合血清抗体IgG，加于微型柱中，于振荡器上室温孵育1 h，使抗体结合。洗涤去除未结合的抗体。加入二甲基亚砜(DMSO)溶解辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)，将溶解的DSS加于结合的微型柱，使抗体与蛋白A/G交联。洗涤去除未交联的抗体。

4. 结核分枝杆菌菌体抗原的免疫共沉淀：取结核分枝杆菌粗制抗原溶液600 μl，加入至抗体交联完成的微型柱中，轻摇混匀，置4 ℃放置过夜，使抗原抗体充分结合。以5228×g离心1 min，加洗涤缓冲液洗涤微型柱。通过12%凝胶浓度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS -PAGE)进行分析。

5. 血清学抗原的WB分析：将洗脱抗原及菌体粗制抗原进行12%SDS-PAGE分离，通过150 mA恒流转膜2 h，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜。将30份(例)结核病患者血清剔除提取过抗体IgG的20份(例)，取剩余的10份(例)血清混匀，从收集的健康体检者血清中采用随机数字表抽样法抽取10份(名)混匀(与结核病患者血清组样本数保持一致，剩余血清暂时不再使用)，分别以1∶50稀释，37 ℃温浴2 h，再以磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次，以1∶2000稀释的HRP标记羊抗人IgG为二抗，37 ℃ 温浴1 h，PBST洗膜3次，通过DAB显色，观察结果。

6. 质谱鉴定和数据库检索：根据WB阳性结果，分析电泳后蛋白条带，切取结核病患者血清识别的特异条带置微孔板，用乙腈溶液脱色并干燥。将含12.5 mg/L的胰蛋白酶消化液加入胶条，37 ℃消化过夜。通过含甲酸500 ml/L的乙腈溶液提取，收集上清，于氮气中保护干燥，重溶于含20 ml/L乙腈溶液和10 ml/L三氟乙酸溶液。将样品进样至串联飞行时间质谱主机基质辅助激光解吸电离技术(Tempo LC-MALDI)点靶系统。样品在含20 ml/L乙腈溶液和1 ml/L三氟乙酸缓冲液与含980 ml/L乙腈溶液和1 ml/L三氟乙酸缓冲液梯度范围内洗脱，洗脱的馏分以1∶1的比例与含10 mmol/L磷酸铵的7 g/L α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)基质混合，点样至飞行时间质量分析器(OPTI-TOF LC/MALDI)的123 mm×81 mm平板(应用生物系统)。以美国AB SCIEX公司生产的5800 MALDI TOF/TOF分析仪分析基质辅助激光解吸电离样品(MALDI)板。分析的数据以软件GPS(V3.6)检索。搜索参数如下：数据库为NCBInr 20100724，11505486序列，3925745078残基，且限定物种为结核分枝杆菌复合群(27212序列)，胰酶酶切，一个漏切位点，一级质谱的容差为100 ppm(1 ppm=1 mg/kg)，二级质谱的容差为0.6 Da(1 Da=1 g/mol)。经过数据库检索后，肽得分大于23分被认为鉴定成功(P<0.05)。

结 果

一、免疫共沉淀筛选血清学抗原

以BCA蛋白定量法测定结核分枝杆菌菌体粗制抗原蛋白浓度为418 mg/L，粗制抗原与经交联免疫共沉淀试剂盒免疫共沉淀获得纯化抗原的SDS-PAGE见图1。由图可知，在相对分子质量约为16 000(16 kDa)处获得一条能被结核病患者血清抗体特异性识别的蛋白质条带。

M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：结核分枝杆菌粗制抗原；2：结核分枝杆菌免疫共沉淀纯化抗原图1 免疫共沉淀纯化抗原的电泳图谱

二、免疫共沉淀纯化抗原的WB分析

免疫共沉淀纯化抗原的免疫印迹结果见图2。由图2可知，在约16 kDa处的纯化抗原能被结核病患者血清抗体特异性识别，而不能被健康人血清抗体识别，表明经免疫共沉淀筛选获得结核病患者血清特异性识别的血清学抗原。

M：预染蛋白质相对分子质量标准；1：纯化抗原与结核病患者血清反应结果；2：纯化抗原与健康人群血清反应结果图2 免疫共沉淀纯化抗原WB图谱

三、结核分枝杆菌洗脱抗原的质谱鉴定

切取结核病患者血清抗体识别的特异条带，进行串联飞行时间质谱分析。所得质谱数据进行数据库检索，鉴定出3种蛋白质，分别为结核分枝杆菌Hsp16.3、铁调控Lsr2蛋白前体、糖基转移酶蛋白，鉴定结果见表1。鉴定3种蛋白质的特异性质谱图分别见图3～5。另外，在16 kDa处发现了41 kDa的糖基转移酶，可能是在冰浴超声处理抗原时蛋白质肽键断裂，鉴定的糖基转移酶是肽键断裂后形成的肽链。

讨 论

一、Hsp16.3的生物学功能及结核病诊断研究现状

抗原的选择对结核病的血清学检测具有关键作用，因此筛选出具有结核病诊断价值的抗原尤为重要。近年来，越来越多的研究表明，结核分枝杆菌的细胞壁碎片可作为引起宿主免疫反应的蛋白抗原[7-10]。

表1 结核分枝杆菌洗脱抗原的质谱鉴定蛋白质的信息

注登录号、得分、等电点的检索数据库均为NCBInr 20100724

F、Y：鉴定的肽段序列；y：C端碎片离子；b：N端碎片离子；+1：指离子峰出现在质荷比数值+1所在的位置图3 Hsp16.3 蛋白质质谱鉴定图谱

A、H、R：鉴定的肽段序列；y：C端碎片离子；b：N端碎片离子；+1：指离子峰出现在质荷比数值+1所在的位置图4 铁调控Lsr2蛋白前体蛋白质质谱鉴定图谱

A、V、M、R：鉴定的肽段序列；y：C端碎片离子；b：N端碎片离子；+1：指离子峰出现在质荷比数值+1所在的位置图5 糖基转移酶蛋白质质谱鉴定图谱

Hsp16.3是结核分枝杆菌中存在的一类小分子热休克蛋白，又名Hsp X，相对分子质量为16 217，主要存在于结核分枝杆菌细胞壁上，在培养液中亦可见，Hsp16.3与结核分枝杆菌的感染和长期潜伏密切相关，它也是结核分枝杆菌休眠期表达量增加最多的蛋白，结核分枝杆菌进入巨噬细胞时即能刺激其大量表达，Hsp16.3在巨噬细胞内的表达可导致巨噬细胞本身的蛋白质表达发生改变[11]，并加强结核分枝杆菌菌体在巨噬细胞内的抵抗力，Hsp16.3还能诱导树突状细胞成熟，通过髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)和β干扰素Toll 样受体结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon β，TRIF)信号通路诱导炎性细胞因子的产生[12]。苏明权等[13]研究发现，以Hsp16.3的ELISA检测临床样品中的结核分枝杆菌抗体的敏感度为67.0%，准确度为84.0%，具有潜在诊断应用价值。Niu等[14]研究发现，Hsp16.3-Mtb10.4融合蛋白能被结核病患者和结核分枝杆菌潜伏感染者明显识别，在免疫佐剂作用下产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答。Zhang等[15]研究表明，Hsp16.3、ESAT6和Ag85B可作为活动性结核病和潜伏性结核感染诊断的潜在生物标志物，Weldingh等[16]重组纯化了35种结核分枝杆菌蛋白，建立ELISA对结核病分析血清学反应，结果发现在所有重组抗原中Hsp16.3能被最多的结核病患者血清抗体特异识别，成为筛选出的最重要的血清学单一抗原，其识别率达46%～98%，并维持97%的特异度；针对HIV共感染的免疫缺陷患者一般难以检测出特异抗体的难题，研究结果显示，Hsp16.3能识别出85%以上的HIV共感染结核病患者样本，提示Hsp16.3可作为HIV共感染结核病的诊断重要抗原。近期，Soong等[17]对人Hsp16.3特异性抗体VH区域优化成功，提高了抗原抗体结合亲和力，为Hsp16.3抗原检测试剂盒开发的研究提供了条件。本研究以结核病患者血清IgG筛选结核分枝杆菌菌体抗原也获得了Hsp16.3，且能被结核病患者血清抗体特异性识别而不被健康体检者血清抗体识别，再次证明Hsp16.3作为一种重要的血清学抗原，具有较好的血清学诊断应用前景，为Hsp16.3在结核病血清学诊断中的应用进一步提供了实验依据。

二、糖基转移酶的生物学功能和对结核病诊断的潜在应用价值分析

糖基转移酶具有催化生物体内活化糖基连接到受体分子的功能，可将糖基转移到D-N-乙酰葡糖胺分子上以形成衔接双糖，是分枝杆菌生长所必需的酶[18]。研究表明，糖基转移酶也可能与结核病的检测具有关联，王爽等[19]克隆表达了阿拉伯糖基转移酶，并证实该蛋白能与结核病患者血清发生特异性反应，Alvarez-Corrales等[20]在全血细胞分析试验中发现，结核分枝杆菌重组蛋白糖基转移酶作为免疫性靶抗原，能被免疫细胞识别直接引起细胞免疫应答，诱导高水平IFN-γ的产生，提示糖基转移酶可能作为一种免疫性抗原分子引导结核病诊断的进一步发展。本研究在结核病患者血清筛选的抗原中也鉴定出了糖基转移酶，由此表明，糖基转移酶不仅具有酶的催化功能，同时作为一种蛋白质也可能在结核分枝杆菌与感染机体相互作用中发挥免疫抗原分子的作用。

三、Lsr2蛋白的生物学功能和对结核病诊断的潜在应用价值分析

Lsr2蛋白是一种具有组蛋白特性的DNA桥接拟核结合蛋白，通过形成核蛋白复合体在基因组的聚合与组建中发挥作用[21]。研究表明，Lsr2蛋白也是结核分枝杆菌适应环境中氧浓度变化的转录调控因子，维持结核分枝杆菌在宿主内的持续感染，是一种结核分枝杆菌潜伏感染相关抗原，如缺乏Lsr2蛋白，结核分枝杆菌将无法在氧浓度过高或过低的环境中存活[22]。近期，孙卫国等[23]研究表明，体外重组表达的Lsr2蛋白能在WB试验中被结核病患者血清特异性抗体识别，而健康组血清没有出现阳性条带，由此推测Lsr2蛋白可能作为结核感染的一种候选靶抗原。本研究结核病患者血清筛选的抗原中也鉴定出了Lsr2蛋白，也在WB试验中被结核病患者血清特异性抗体识别，而健康体检者血清抗体不能识别，与其研究结果一致，提示Lsr2蛋白可能会作为一种全新的结核分枝杆菌抗原逐渐被重视和研究。

四、实验设计局限性分析

本研究通过免疫共沉淀偶联质谱技术筛选获得Hsp16.3、糖基转移酶和铁调控Lsr2蛋白前体这3种能被结核病患者血清IgG特异性识别的血清学抗原，可能具有潜在的血清学诊断价值。同时，可能因筛选抗原所用血清来自于部分结核病患者血清，其抗体水平不能代表结核病患者整个群体，尚有多种常见结核病血清学抗原未筛出，且体外筛选结核分枝杆菌抗原与体内抗原筛选仍然存在一定差异，因此本研究可能也存在一定局限性。另外，本实验在16 kDa处发现了41 kDa的糖基转移酶，可能是由于在制备结核分枝杆菌菌体抗原时使用了冰浴超声法破碎菌体，而超声处理过程中，大量的空穴气泡可使蛋白颗粒周围形成较大的压强，促使蛋白质结构展开肽键断裂，因此在16 kDa处发现的41 kDa的糖基转移酶可能是糖基转移酶肽键断裂后形成的肽链。未来，笔者还会继续改进并重组表达筛选的抗原，分析其免疫诊断结核病的价值，以期为结核病的血清学诊断提供依据。