陈绮映,林超,杨荣丰,黄荣,王丽丽*
(1.中国医学科学院阜外医院深圳医院心内科,广东 深圳 518000; 2.中山大学附属第七医院儿科,广东 深圳 518000)
内皮细胞的功能损伤、死亡,被认为是动脉粥样硬化 ( AS) 发病的早期关键性环节[1]。内皮细胞的死亡方式有两种,凋亡和坏死。动脉粥样硬化的各种致病因素如:吸烟、肥胖、高血压、高血糖、高血脂等均可引起内皮细胞凋亡。近年来的许多研究也已经证实内皮细胞凋亡是AS病变的主要特征之一,并在AS的形成和发展中起了重要的作用[2,3]。
近年来关于肠道菌群与疾病的相关性研究不断涌现,肠道菌群在人类健康中的作用也越来越得到人们关注。随着对肠道菌群研究的逐步深入,发现肠道菌群及其代谢产物TMAO可能通过促进AS的发生发展,成为心血管疾病的又一危险因素[4,5]。然而目前,关于TMAO与内皮细胞凋亡的研究较少,TMAO促进AS的发生,是否与内皮细胞凋亡有关,目前尚未得知。
现已发现的人参皂苷单体众多,其中人参皂苷Rh1是备受关注的单体之一。研究表现人参皂苷Rh1可促进内皮细胞增殖,提高细胞活性[6]。然而人参皂苷Rh1究竟是通过什么方式发挥内皮细胞保护作用,目前仍未定论。与此同时,研究发现人参皂苷Rh1可抑制乳腺癌细胞的凋亡[7]。然而,目前尚未有关于人参皂苷Rh1与内皮细胞凋亡的研究。本研究以 TMAO诱导人脐静脉内皮细胞凋亡为模型,探讨人参皂苷的保护作用,为保护血管内皮功能和防治开辟新途径。
人脐静脉内皮细胞购于中国科学院上海生命科学研究院提供,TMAO购于Sigma公司,人参皂苷Rh1购于成都瑞芬思生物科技有限公司,EDU细胞增殖试剂盒购于锐博生物科技公司,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术公司,ECM培养基购于北京裕恒丰科技有限公司,其配套的内皮生长因子胎牛血清购于Invitrogen-Gibco公司,DMEM 培养基购于Gibco 公司,流式细胞检测采用B D的FACSVerse流式细胞仪进行检测,细胞荧光的检测采用日本的olympus显微镜,Caspase-3抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。
内皮细胞的增殖采用EDU增殖实验进行检测。内皮细胞消化后,按照4 ×103个/孔的细胞量传到96孔板中。实验分为对照组、TMAO组、人参皂苷Rh1组、TMAO+人参皂苷Rh1组。TMAO组加入100 μmol/L的TMAO{GuoHua Ma},人参皂苷Rh1组加入200 μmol/L的人参皂苷Rh1( Wonhwa Lee,),TMAO+人参皂苷Rh1组在加入100 μmol/L的TMAO的同时加入的200 μmol/L人参皂苷Rh1。细胞贴壁后加入刺激因素,处理24 h,加入EDU染色反应液。继续培养6 h后,弃培养液,PBS清洗细胞1~2次,每次5min。每孔加入4%的多聚甲醛固定30min,之后用2 mg/ml甘氨酸脱色摇床孵育5 min。PBS清洗3次后,加入0.5 %TritonX-100的PBS,脱色摇床孵育10 min。各组加入EDU染色反应液,避光,室温脱色摇床孵育30 min。用含0.5 % TritonX-100的PBS清洗3次后,进行DAPI染色封片。之后在荧光显微镜下面观察 细胞增殖的状态。
细胞分组同前,内皮细胞在加入刺激因素后,继续培养48 h,之后用胰酶消化后,1 000 转离心5 min。弃上清,每组加入195ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。之后加入5ul Annexin V-FITC,轻轻混匀。室温避光孵育10 min后,离心,弃上清。加入1905ul Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞,最后加入10 μL碘化丙啶染色液,轻轻混匀,进行流式细胞学检测。
细胞分组同前,内皮细胞在加入刺激因素后,继续培养48 h,之后用胰酶消化收集细胞。细胞用细胞裂解液裂解,收集蛋白。凝胶电泳和转膜后加入caspase-3的一抗,37 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶偶联的二抗,孵育2 h,0.01 mol/L PBS洗膜,5 min×4次。加入显色液,避光显色。
如图1显示,相对于对照组,TMAO可以显著抑制内皮细胞的增殖(P<0.05)。单独的人参皂苷Rh1对内皮细胞的增殖没有显著的影响,但是人参皂苷Rh1的加入可以扭转TMAO对HUVECs细胞增殖的抑制作用,相对于TMAO组增殖率明显升高(P<0.05),见图1。
合成DAPIEDU对照RhqTMAOTMAO+Rh1
图1 人参皂苷Rh1削弱TMAO对内皮细胞增殖抑制的作用
如图2所示,Western-blot实验结果显示TMAO可以上调HUVECs凋亡相关基因caspase-3的蛋白表达(P<0.05)。当加入人参皂苷Rh1后,可以发现这种上调作用受到了抑制(P<0.05)。
流式细胞检测的结果显示TMAO可以诱导HUVECs凋亡,凋亡细胞的比例明显增加 (P<0.01)。单独人参皂苷Rh1对内皮细胞的凋亡没有显著的影响,但是可以抑制TMAO引起的内皮细胞的凋亡 ,凋亡的细胞数相对于TMAO组明显降低(P<0.01)。见 图3。
1234Caspase-3GAPDH
图2 人参皂苷Rh1削弱TMAO上调内皮细胞Caspase-3蛋白表达的作用
TMAO+Rh1TMAORh1对照组
图3 人参皂苷Rh1削弱TMAO诱导的内皮细胞凋亡的作用
动脉粥样硬化是一种慢性的、多种致病因素作用下诱发的血管疾病,是发展中国家心血管事件死亡的主要原因。内皮损伤及功能紊乱被认为是动脉粥样硬化的始动环节[8]。研究发现,凋亡内皮细胞可导致内皮功能障碍,并诱发动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成,对动脉粥样硬化的发生和发展有着重要的意义[9-10]。因此,寻找新的延缓内皮细胞凋亡的生物因子或机制,可为防治动脉粥样硬化提供新的靶点。
肠道菌群与动脉粥样硬化疾病的关系研究,是近年来的研究热点。TMAO作为肠道菌群在人体的主要代谢产物,已被证明与动脉粥样硬化疾病的发生和发展密切相关[11-12]。 我们的研究发现,TMAO干预的HUVECs出现细胞增殖下降、凋亡上调的情况,再次验证了TMAO诱导内皮细胞凋亡的作用。
人参皂苷是传统中药人参中的主要有效成分,被证实有多种生理作用。截至目前,已有超过40种人参皂苷单体从人参中分离提取出来,其中含量较高主要有Rb1、Rg1、Rh1等。其中,人参皂苷Rh1可发挥广泛的生理效应,如:抗炎、抗氧化应激、免疫调节、内皮保护等。我们的研究发现,人参皂苷Rh1可对抗TMAO诱导的内皮细胞凋亡,并促进内皮细胞增殖。这就提示,人参皂苷Rh1可能通过对抗TMAO诱导的内皮细胞凋亡,发挥内皮保护作用。然而,人参皂苷Rh1的内皮细胞凋亡的保护作用的具体机制,尚有待进一步研究。我们会在后续的研究中,从分子机制的层面展开探究,并在动物实验层面上验证。本研究为此提供了思路。
综上所述,我们的研究表明,人参皂苷Rh1可对抗TMAO诱导的HUVECs凋亡,继而发挥内皮保护作用。