基于响应面的余甘果脱涩工艺优化

梁惠芬，曾鑫海，冼宇婷，陈慧霞，林梓琳，王洁如，张振霞，郑玉忠

（韩山师范学院，广东 潮州 521041）

余甘果（phyllanthusemblicaL.） 又名牛甘果、余甘子、油甘果、油柑等，为双子叶植物纲、大戟科叶下珠属植物[1,2]。余甘果喜光，主要分布在福建、台湾、广东、广西、贵州、云南等热带、亚热带地区[1-3]。同时余甘果适应性强，并且耐干旱[4]，根系发达，有利于保持水土，有利于维护生态环境的正常。对余甘果的资源保护、开发、研究有着重要的意义。余甘果具有抗衰老[5]、抗坏血酸[6]、抗肿瘤[7]、降血压[8]、降血脂等功效，润肺化痰，生津止渴，增进食欲，可治喉炎和乙肝肝炎[9]功效，能明显治疗和预防胃癌[1]。治疗咽喉不适、烟酒过度、胆道蛔虫绞痛等[4]，更是立竿见影。果肉含有丰富的维生素C[10]、E、B、Cu[11]等多种微量元素以及超氧化物歧化酶（SOD）[12,13]。其果果味先苦后甘，肉厚、纤维少、营养丰富、产量高、效益好等特点。果实中含有多酚，生物碱，黄酮等多种生物活性物质[14-16]。

目前，国内对然已有对余甘果的加工的研究报告，但是对其脱涩工艺的优化研究鲜有报道。余甘果中含有多酚，生物碱，黄酮等多种生物活性物质，其中多酚含量最高，而多酚中以单宁为主要成分[17]。单宁是果实中涩味的重要代表物，脱涩程度越高，果实中的单宁含量越低。因此，本实验以新鲜余甘果为原料，采用分光光度法测定单宁提取率，并以单宁的提取率作为指标，利用响应面法对余甘果脱涩工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为新鲜余甘果，2019 年7 月中旬采购于广东省潮州市农贸市场，置于4℃冰箱短期冷藏。

实验试剂包括单宁酸、乙醇、丙三醇、邻二氮菲、冰醋酸、乙二胺四乙酸二钠、六合水三氯化铁、无水乙酸钠，均为分析纯。

实验仪器：超声波清洗仪（S22H，致微厦门有限公司）、电子天平（BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司）、恒温水浴锅（XMTD203，金坛市科析仪器有限公司）、台式高效冷冻离心机（H1850R，湖南湘怡实验仪器开发有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A 型，上海精宏实验设备有限公司）、紫外可见分光光度计T6新世纪（北京普析通用仪器有限公司）、高速多功能打粉机（CS-700, 永康市天祺盛世工贸有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制

精密称取单宁酸5mg，置于25 mL 容量瓶中，用蒸馏水溶解定容，作为0.1mg/mL 单宁标准溶液，分 别 取0μL、400μL、 800μL、 1200μL、1600μL、2000μL 单宁标准溶液于6 个25 mL 棕色容量瓶中，加入5 mL 蒸馏水和125μL 的0.1 mol/L FeCl3溶液，静置20min，再加入5 mL 邻二氮菲缓冲溶液 [m（0.015mol/L 邻二氮菲）∶m（NaAc 缓冲溶液）∶m（0.05mol/L EDTA） =10∶5∶1]定容，静置10min，在510nm 处测定各浓度的吸光度。以吸光度为纵轴，单宁浓度为横轴绘制标准曲线，得Y=0.2862X+0.0346，R2=0.9925。每次测定提取液获得吸光度值带入标准曲线方程，再换算成余甘果中单宁含量。

1.2.2 试样制备

准确称量40 g 余甘果，烘干至恒重再称量，得出干重比。称取5.0 g 鲜果打碎，以m（水） ∶m（甘油） =9∶1 作为提取溶剂，提取时间为30 min，提取功率为100 W，多次提取，至溶液颜色清澈，合并滤液，抽取部分检测，通过邻二氮菲分光光度法[18,19]测定单宁含量。加入0.1mol/L FeCl3溶液与样品液反应，再加入邻二氮菲溶液反应，在510nm 处用分光光度计对反应后的溶液进行吸光度检测，根据单宁标准曲线计算余甘果中总单宁含量。

2 单因素试验

2.1 比较不同提取溶剂对单宁提取率的影响

将余甘果切半处理，以时间60 min、温度为40℃、功率为100 W，料液比为1∶40（g/mL） 为提取条件，比较水、乙醇、水+甘油（4∶6）、乙醇+甘油（4∶6） 作为提取溶剂的提取效率。经数据处理后，结果如图1 所示。

五种提取溶剂提取率依次为：乙醇+甘油（13.91%）、水+甘油（11.83%）、乙醇（10.25%）、甘油（4.63%）、水（2.31%）。其中，乙醇+甘油的提取率最高，虽然比水+甘油的提取率高2.08%，但考虑环境和成本问题，选择水+甘油作为单宁提取剂。通过分析数据，可得出，甘油的加入后，提取率明显提高。

图1 不同提取溶剂对单宁提取率的影响Fig.1 Effects of different extraction solvents on the yield of tannins.

2.2 水和甘油混合溶剂的配比对单宁提取率的影响

为优选出水和甘油的最佳混合比例对单宁提取率的影响。准确称取余甘果14 g，中间切半处理，以时间为60 min，温度为40℃、功率为100 W 作为提取条件，考察甘油与水混合比例分别为：2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4 对单宁提取率的影响，进一步确定水和甘油的混合比例对单宁提取率的影响。结果如图2 所示。分析数据后，确定m（甘油） ∶m（水） =4∶6 的单宁提取率最高。

图2 不同混合比例对单宁提取率的影响Fig.2 Effects of different mixing ratios on the extraction yield of tannins.

2.3 料液比、温度、时间对单宁提取率的影响

精确称取14 g 新鲜余甘果，中间切半处理，提取溶剂为水+甘油，按下列提取条件提取，每次重复3 次试验。

1） 料液比（g/mL） 分别为20∶1、40∶1、60∶1，时间为60 min，温度为40℃、功率为100 W；

2） 提 取 时 间 分 别 为60min、100min、140 min，料液比1∶40，温度为40℃、功率为100 W；

3） 提取温度分别为20℃、40℃、60℃，料液比1∶40，时间为60℃、功率为100 W。

2.4 响应面试验设计

根据Box-Benhnken 试验设计原理，以单因素试验结果为参考，把单宁提取率（%） 作为响应值，选取料液比（g/mL）、提取时间（min）、提取温度（℃） 3 个影响因素为自变量，采用三因素三水平的响应面优化以上因素，水平及因素编码如表1 所示。

表1 响应面水平及因素编码Tab.1 Response surface level and factor coding.

3 结果与分析

3.1 三因素的试验结果

3.1.1 提取温度对单宁溶出率的影响

根据图3 可知，单宁溶出率随着提取温度的增加而增大，60℃的提取温度比40℃的提取温度的单宁提取率略大。当提取温度为60℃时单宁提取率最高。考虑单宁受热易分解的特点，选择提取温度为20、40、60℃作为响应面考察条件。

图3 提取温度对单宁溶出率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on tannin dissolution rate

3.1.2 提取时间对单宁溶出率的影响

根据图4 可知，单宁溶出率随着时间的增加先增大后减少。

图4 提取时间对单宁溶出率的影响Fig.4 Effect of extraction time on tannin dissolution rate

当提取时间达到100 min 是单宁提取率最高。再增加提取时间，单宁提取率略有下降趋势。时间过短，单宁类物质不能完全溶出，单宁提取率低下。时间过长，可能导致其他一些杂质成分溶出，损耗人力物力，并造成单宁提取率下降。根据以上结果分析，综合考虑，选择提取时间为60、100、140 min 作为响应面考察条件。3.1.3 料液比对单宁溶出率的影响

根据图5 可知，单宁溶出率随着料液比的变化先增大后减少。

图5 料液比对单宁溶出率的影响Fig.5 Effect of ratio of feed to liquid on tannin dissolution rate

在料液比为1∶40（g/mL） 时，单宁提取率达到最大。如果料液比太小，则单宁溶出不够充分；而料液比太，单宁溶出率反而降低，可能由于样品中溶出某些杂质导致的。除此之外，提取溶剂用量过大不仅增加生产成本，后期相应的提取处理工作的难度也会增加，从而降低单宁的提取率。综合实际分析，选择料液比为1∶20、1∶40、1∶60（g/mL） 作为响应面水平。

3.2 响应面优化余甘果中单宁的提取工艺

以单因素试验结果作为参考依据，以单宁提取率作为响应值，选取表2 中的三因素作为响应面优化因素，每次试验均重复3 次。应用Design Expert 8.0.6 软件对响应面试验结果进行回归拟合分析，可得出单宁得率=16.66-0.71×A-1.26×B+0.69×C-0.96×A×B+1.21×A×C+0.070×B×C-1.98×A2-0.99×B2+1.16×C2，公式中：A 为提取温度（℃），B 为料液比（g/mL），C 为提取时间（min）。

3.2.1 回归方差数据结果

通过相关系数与方差分析结果来检测回归方程的准确性和有效性，考察该数学模型是否可靠。由表3 可知P< 0.01，说明回归模型达到显著水平，失拟项P=0.1772>0.05，表现为“不显著”，说明失拟项对于纯误差不显著，表明该模型是合适的。变异系数CV (%) =7.05<10，说明试验可重复性较好。相关系数R2=0.8652，大于0.8，可知拟合程度很好，表明响应值单宁提取率实际值与预测值之间具有较好的拟合度，能较好地对响应值进行分析。从表3 得出，料液比表现为对余甘果单宁提取率影响显著，提取温度的二次项表现为对余甘果单宁提取率影响极显著，根据F 值的大小可得出各因素对余甘果单宁提取率影响的顺序为：提取料液比（B） ＞温度（A） ＞提取时间（C）。

表2 余甘果单宁提取中心组合试验方案及结果Tab.2 Combination test scheme and results of tannin extraction center of acanthopanaxdfficinalis

表3 回归方程分析表Tab.3 Regression equation analysis table

3.2.1 响应面试验因素相互影响分析

响应面曲面坡度平滑时，表明响应值受变量交互作用的影响小。反之，当响应面曲面坡度陡峭时，则表明响应值受变量交互作用的影响大。根据回归模型，以提取温度、提取时间、料液比中的两个因素固定为零水平，就可以得出另外两个因素的交互作用。模型的响应面如图6～图8 所示。A（提取温度） 与B（料液比） 之间的响应面曲面坡度最陡，表明提取温度与料液比的交互作用对余甘果单宁提取率的影响显著。其次，A（提取温度） 与C（提取时间） 响应面曲面坡度较陡峭。C（提取时间） 与B（料液比） 响应面曲面坡度较平滑，说明该两种因素的交互作用对余甘果单宁提取率的影响不显著。

图6 提取时间与料液比两因素之间的交互作用Fig.6 Interaction between extraction time and feed ratio

图7 料液比与提取温度两因素之间的交互作用Fig. 7 Interaction between material ratio and extraction temperature

图8 提取时间与提取温度两因素之间的交互作用Fig. 8 Interaction between extraction time and extraction temperature

3.2.2 最佳提取工艺的验证与确立

运用响应面分析结果，可以得到余甘果单宁提取工艺的最佳提取工艺参数为：提取时间为56.64℃，料液比为1∶22.47（g/mL），提取时间为110 min，超声波功率为100 W 的条件下单宁提取率的理论值为19.04%。为了验证结果的真实性、可靠性与实际操作的方便性，将实际提取工艺参数调整为提取时间为57℃，料液比为1∶23（g/mL），提取时间为110 min，超声波功率为100 W。在此提取条件下，进行3 次平行试验，得出实际单宁提取率平均值为14.83%，与理论值19.04%几乎吻合，误差在5%以内，表明该回归模型真实可靠，具有实际应用价值。

4 结论与分析

本试验尝试将单宁提取的方法引用到脱涩工艺上，并且也得到了不错的效果。不仅能将涩味极重的单宁在简便的脱涩工艺下快速的果实中提取出来。经文件检索后，此前一般以余甘果粉末为试验原材料，无法保证果实完整性。本试验采用余甘果鲜果进行单宁提取，能较大的保留着果实的完整性，减少其营养成分的流失。而在脱涩工艺上所运用到的甘油是良好的单宁提取溶剂并且具有价格低廉、安全无毒等特性。此前，国内使用甘油作为单宁的提取溶剂提取单宁的文章鲜有所见。

通过单因素试验，比较并确立最佳的提取溶剂为40%甘油。在确定最佳的提取溶剂基础上，对提取温度、提取时间、提取料液比进行试验。试验结果显示提取温度为60℃、提取时间为100 min、提取料液比为1∶40 的提取效率较高。根据以上实验，运用Design Expet8.06 设计响应面并分析比对提取时间、提取温度、提取料液比3 个因素。经过分析最终确定最佳的提取工艺为：40%的甘油为提取溶剂，提取时间为57℃，料液比为1∶23（g/mL），提取时间为110 min，得到余甘果单宁的提取率为14.83%，误差在5%以内。

单宁提取率稍微偏低，其一，由于采用不同月份余甘果果实进行重复性实验，不同时期的果实成熟度不同，果实的软硬程度对实验存在一定的影响。其二，响应面提供的理论结果与实验结果本身存在一定的偏差。但总体偏差在误差范围内，说明该回归模型真实可靠，具有实际应用价值，可作为单宁提取的一种优化方法。