脂联素在脑梗死不同亚型病程中的变化规律研究

张向晖, 周官恩

脂肪组织可分泌有活性的化合物[1]。脂联素是一种30 kDa的蛋白质，主要由脂肪细胞合成，也由骨骼肌、内皮细胞和心肌细胞产生[2]。脂联素在血液中以3种分子形式在高水平循环：低分子量(LMW)三聚体形式、中分子量(medium molecular weight，MMW)六聚体形式和高分子量(high molecular weight，HMW)多聚体。脂联素通过直接作用于心脏和血管中的组分细胞来介导对心血管系统的有益作用[3,4]。脂联素与中心性肥胖和脑血管疾病有关[5]。冠状动脉疾病患者以及心力衰竭患者血浆总脂联素(total adiponectin，tAPN)水平降低[6]。脂联素是一种在体内有保护作用的脂肪因子，例如,抗动脉粥样硬化和抗炎症特性[7]。它还增加胰岛素敏感性，并维持能量平衡、葡萄糖代谢和脂质代谢，这与缺血性卒中的发生率密切相关[8]。脂联素可抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)粘附分子的表达和单核细胞粘附于内皮细胞，降低清道夫受体的表达[9]。脂联素可抑制受损的血管内膜增生，使平滑肌细胞增殖和迁移，以减少斑块大小[10]。脂联素是一种心血管保护分子，与野生型对照相比，脂联素敲除小鼠有更大的梗死面积、更大的心肌细胞凋亡和增加的TNF-α表达[11]。本研究探究不同分子量脂联素在脑梗死不同亚型病程中的变化及相关性。

1 材料和方法

1.1 一般资料 选取2017年8月-2019年2月来我院检查确诊为脑梗死患者182例为病例组，其中男性患者106例(58.24%)，女性患者76例(41.75%)。患者平均年龄为(56.34±6.78)。其中脑梗死亚型大动脉粥样硬化性卒中68例(37.36%)，小动脉闭塞性卒中59例(32.41%)，心源性脑栓塞55例(30.21%)；选取来我院进行健康体检的115例非脑梗死患者作为对照组进行实验。对照组之前无过心脑血管疾病和脑部相关手术，无任何先前的神经系统疾病，在磁共振成像上无明显的结构异常。病例组和对照组在性别、体重指数和年龄上无差异性统计。入选标准：性别不限；首次脑梗死发病，时间为24 h内入选；病前无服用过抗脑梗死类药物。排除标准：血液系统疾病；脑部无其他手术史；严重心脏病患者；严重糖尿病史；脑肿瘤、脑血管畸形；精神疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 血液样本采集 对于样本的采集为分批进行，共计采集4次。在第1天、第4天、第10天和第14天晚上10点后禁止如食，早上进行空腹静脉采血每次抽取3 ml，将来自静脉的血液样品收集在含有EDTA(1.6 mg/ml血液)和抑肽酶蛋白酶抑制剂(50 KIU/ml血液)的无菌管中(BD公司，美国)。将血液样本放入3000转/分离心机内离心10 min用于血清和血细胞的分离，-70 ℃储存。

1.2.2 蛋白质免疫印迹 通过免疫印迹测定血清液中各分子量脂联素蛋白表达。将血清液置于含有蛋白酶抑制剂的冰冷PBS裂解缓冲液(pH7.4)中，匀浆并在冰上置45 min，离心后-80 ℃储存。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质(30 μg/泳道)并转移至硝酸纤维素膜(伯乐生命医学产品有限公司，上海)进行免疫印迹。然后将膜与兔多克隆抗tAPN、HMW脂联素、MMW脂联素和LMW脂联素(1∶200；赛默飞世尔科技有限公司，上海)孵育。在室温下1 h，洗涤，并与PBS-T中的第二HRP缀合的山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体(1∶20,000；赛默飞世尔科技有限公司，上海)孵育1 h。单克隆抗β-肌动蛋白抗体作为内部对照重新探测，通过光密度测定含量。

1.2.3 血清脂联素含量测定 将血清样本稀释后(每孔50 μl)加入到96孔多层板(国药集团化学试剂有限公司，上海)中,并在37 ℃下孵育1 h。用200 μl BlockAce(赛默飞世尔科技有限公司，上海)在37 ℃下封闭每个孔1 h。然后每孔使用250 μl PBST洗涤孔3次，并向每个孔中加入50 μl稀释的抗体。将板在37 ℃下孵育1 h。然后将板用每孔250 μl PBST洗涤3次，与每孔50 μl稀释的HRP-缀合的兔抗山羊IgG或HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG一起在37 ℃温育1 h。然后将板每次用250 μl PBST洗涤5次。向每个孔中加入50 μl TMB+底物色原(上海玉博生物科技有限公司，上海)并在室温下温育3 min。通过加入50 μl 1 M H2SO4终止显色。使用Molecular Devices SPECTRA max PLUS 384(美谷分子仪器有限公司，美国)在450 nm的波长下测量吸光度。

2 结 果

2.1 研究对象的分组 脑梗死患者182例为脑梗死组(n=182)，其中男性患者106例(58.24%)，女性患者76例(41.75%),患者平均年龄为(60.34±7.78)。其中脑梗死亚型大动脉粥样硬化性卒中68例(n=68，37.36%);小动脉闭塞性卒中59例(n=59，32.41%);心源性脑栓塞55(n=55，30.21%)。研究对象中在冠心病史、吸烟史、高血压史上脑梗死组较对照组比例相对升高(P<0.05)。对照组与脑梗死组在年龄、体重指数和男女比例上比较无差异性统计(P>0.05)(见表1)。

2.2 Logistic回归分析不同分子量脂联素在不同TOAST分型病程中的变化 冠心病史、糖尿病史、吸烟史和高血压史均与不同分子量脂联素在不同TOAST分型病程中的变化相关(P<0.05)；而年龄和性别差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

2.3 脂联素蛋白水平测定 与对照组相比，脑梗死组中tAPN蛋白水平降低(P<0.05)，主要表现在HMW脂联素蛋白水平下降(P<0.05);而MMW脂联素蛋白水平增加(P<0.05)，LMW脂联素蛋白水平不变(P>0.05)(见图1、表3)。

2.4 tAPN在脑梗死亚型中的含量测定 与对照组相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大动脉硬化组和心源性脑栓组tAPN水平均降低(P<0.05)；而小动脉闭塞组tAPN水平在病程中呈先下降后回升趋势，在病程第4天至第10天降低(P<0.05)(见图2、表4)。

2.5 HMW脂联素在脑梗死亚型中的含量测定 与对照组相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大动脉硬化组HMW脂联素水平降低(P<0.05)；而小动脉闭塞组HMW脂联素水平在病程中呈先下降后回升趋势，在病程第4天至第10天降低(P<0.05)，心源性脑栓组HMW脂联素水平在病程中呈先下降后稳定趋势(P<0.05)(见表5)。

2.6 MMW脂联素在脑梗死亚型中的含量测定 与对照组相比，MMW脂联素水平在病程中呈先下降后回升趋势，在第4天内大动脉硬化组、小动脉闭塞组及心源性脑栓组MMW脂联素水平升高(P<0.05)；在第10天内大动脉硬化组、小动脉闭塞组及心源性脑栓组MMW脂联素水平无差异(P>0.05)；在第15天内大动脉硬化组、小动脉闭塞组及心源性脑栓组MMW脂联素水平均降低(P<0.05)(见表6)。

2.7 LMW脂联素在脑梗死亚型中的含量测定 与对照组相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大动脉硬化组、小动脉闭塞组及心源性脑栓组LMW脂联素水平相当，与对照组相比无差异性统计(P>0.05)(见表7)。

表1 对照组与脑梗死组患者一般资料对比

表2 Logistic回归分析不同分子量脂联素在不同TOAST分型病程中的变化

表3 对照组与脑梗死组患者脂联素含量比较

表4 对照组与脑梗死组患者tAPN含量比较

表5 对照组与脑梗死组患者HMW脂联素含量比较

表6 对照组与脑梗死组患者MMW脂联素含量比较

表7 对照组与脑梗死组患者LMW脂联素含量比较

图1 对照组与脑梗死组患者脂联素蛋白水平检测

图2 对照组与脑梗死组患者tAPN含量比较

3 讨 论

HMW脂联素是预测脑梗死程度的有用标记。较低水平的HMW脂联素与冠状动脉斑块的严重程度和脆弱特征有关[12]。我们研究中脑梗死血清tAPN和HMW脂联素水平相对较低。脂联素可通过其特异性受体调节葡萄糖和脂质代谢，从而发挥其抗炎和抗动脉粥样硬化作用。

脂联素与许多病理过程有关，并且其合成受到不同方式的调节。作为脂联素的活性形式，HMW脂联素与脑梗死严重程度呈负相关。根据Ambroziak等的研究，血管造影冠状动脉粥样硬化严重程度和冠状动脉高危斑块主要归因于HMW-tAPN比率降低[13]。与对照组相比，HMW脂联素、HMW-tAPN比率与脑梗死严重程度间的负相关性强于tAPN和脑梗死严重程度间的负相关。脑梗死组中tAPN蛋白水平主要表现为HMW脂联素蛋白水平下降，而MMW脂联素蛋白水平增加，LMW脂联素蛋白水平不变。脂肪组织在脑血管疾病过程中会膨胀，变得缺氧并且功能失调。脂肪细胞大小的变化和包括脂联素在内的保护性蛋白质的产生的减少有利于有害的脂肪细胞因子，例如瘦蛋白、抵抗素或IL-6心外膜脂肪中较低的脂联素浓度与冠状动脉疾病患者炎症分子水平升高有关[14]。这些数据可能解释我们对血液中脂联素减少的发现。脂肪组织可作为支持和机械因素，可能是细胞因子和脂肪因子的血管分泌和旁分泌来源。

HMW脂联素是这种蛋白质中最活跃的形式，对于冠状动脉疾病程度来说，其比tAPN更有效和敏感的生物标志物[15]。Song已经证实在小鼠心肌缺血-再灌注损伤后24 h血浆HMW脂联素水平降低[16]。我们的结果表明，与对照组相比，在第1天、第4天、第10天、第15天，大动脉硬化组HMW脂联素水平均降低;而小动脉闭塞组HMW脂联素水平在病程中呈先下降后回升趋势，在病程第4天至第10天降低，心源性脑栓组HMW脂联素水平在病程中呈先下降后稳定趋势。虽然补充外源性脂联素可有效减轻动物的脑血管疾病，但仍然难以将脂联素用作人体内的治疗剂。(1)脂联素的高循环水平是其有益效果所必需的；(2)脂联素活性需要广泛的翻译后修饰；(3)脂联素的半衰期相对较短。我们的结果显示脑梗死患者血清脂联素水平增加。这种作用可能是由心肌细胞局部产生脂联素或从血浆和心脏脂肪组织转运引起的。

综上所述，本研究表明tAPN、HMW与脑梗死密切相关，tAPN、HMW是比MMW和LMW更有效的脑梗死风险的生物标志物，有重要临床价值。