一种高效稳定的大鼠肠粘连模型制备方法

冯成敏，黄文学，张继，王冰，沈成义

(1.川北医学院临床医学系，四川 南充 637000；2.盐源县人民医院，四川 盐源 615700；3.电子科技大学医学院，四川 成都 610054；4.川北医学院医学影像四川省重点实验室；5.川北医学院基础医学院化学教研室；6.川北医学院形态学研究所，四川 南充 637000)

腹腔粘连是外科腹部手术的常见并发症之一，可能导致慢性腹痛、腹胀、肠梗阻和肠坏死等诸多后果[1]，防止腹腔粘连成为临床医学面临的亟待解决重要问题之一[2]。而应用聚合物膜、凝胶等生物材料对术后腹腔粘连的防治是解决这一问题的重要手段[3-4]。动物模型是粘连机制研究及对防治粘连手段进行效果评价的重要载体，因此，制作稳定、可重现性高的腹腔粘连动物模型就显得尤为重要。常见腹腔粘连动物模型有大鼠盲肠摩擦模型、回肠剥离模型等单一损伤模型及盲肠-腹壁粘连模型等多损伤模型[5]。后一种模型常见诸于膜状防粘连材料效果验证研究中[6-7]。在既往对自行研制的膜状防粘连材料效果验证工作中，本小组也采用了大鼠盲肠-腹壁多损伤动物模型，通过长期观察发现，术中盲肠暴露时间以及盲肠-腹壁损伤程度可对该模型最终的粘连率有较大影响。为此，本小组拟通过探讨盲肠暴露时间和盲肠-腹壁损伤程度对大鼠盲肠-腹壁粘连模型的成模率的影响，以期得到制备稳定模型的操作方法。

1 材料与方法

1.1 材料

体重为195～210 g清洁级SD大鼠27只来自于川北医学院实验动物中心[SCXK(川)2013-18]，手术在川北医学院实验动物中心进行[SYXK(川)2013-076]，实验过程对动物的处置符合相关动物伦理学要求。手术材料：无菌干纱布(40 mm ×50 mm)、医用脱脂棉(原南昌美芳医疗器械厂)、一次性注射器(江西洪达医疗器械集团有限公司)、4.0可吸收性缝线(VICRYL Plus，强生医疗器材有限公司)、血管钳、剪刀、持针器、镊子、手术刀柄、手术刀片、止血钳等(均采用高压蒸汽法灭菌)。药物：氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)、碘伏消毒液(四川伊洁士医疗科技有限公司)、医用75%酒精(四川金山制药有限公司)、注射用头孢匹胺钠(山东鲁抗医药股份有限公司)。

1.2 方法

将27只大鼠随机分为A、B、C 3组，每组各9只(表1)。术前12 h禁食，手术当日禁水。准确称重后采用3%戊巴比妥钠(0.69 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉后进行腹部备皮，仰卧位固定于手术台上，常规消毒后铺无菌巾，良好地暴露腹部手术区域。于耻骨联合上1.5 cm沿腹正中线向上做3 cm 切口，逐层打开腹腔，提出盲肠，置于无菌巾上，用手术刀片刮伤盲肠粘膜，致1.5 ×1.5 cm 大小创面(避开肉眼可见血管)，A组及B组见片状出血，C组见点状出血；回纳盲肠，暴露左侧腹壁，于盲肠损伤对应部位以手术刀片刮伤腹壁，致1.5×1.5 cm 大小创面，A组及B组见片状出血，C组见点状出血(图1)。再次取出盲肠，A组暴露至15 min，B组与C组暴露至25 min，用4-0可吸收性缝线经肠系膜将其固定于腹壁，使损伤面对齐，分层缝合关腹。

术后均予以单笼饲养(20～25 ℃保暖)，并于手术前4 d通过腹腔注射给予头孢匹胺钠(1次/d，0.25 g/kg)。术后第8 d，采用颈椎脱臼法处死实验大鼠，剑突下 “[” 型切口开腹。观察盲肠-腹壁粘连情况，统计各组粘连与未粘连大鼠数量，并拍照记录。同时，取粘连处组织(若未粘连，取创伤处腹壁组织)，用4%中性甲醛固定。对组织进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋处理后，切片。苏木精-伊红染色后于显微镜下观察盲肠、腹壁组织损伤深度，并根据炎性细胞数目及浸润面积确定实验部位炎症浸润情况。

表1 盲肠-腹壁粘连模型动物分组情况

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0 软件，运用χ2检验四格表的Fisher确切概率法进行统计学显著性检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠术后一般情况及盲肠-粘连模型粘连率比较

实验过程中大鼠切口愈合均良好，无感染，缝线自然脱落。术后早期大鼠的活动受限、被动仰卧位，术后24 h，各组动物一般状态较差，活动少，少量进水和食物。术后2 d后各组动物一般状态、活动、饮水和进食已基本正常。各组大鼠造模7 d后，盲肠暴露时间为25 min、盲肠-腹壁重度损伤的B组粘连率(88.9%)明显大于A组(11.1%)和C组(33.3%)，经χ2检验四格表的Fisher确切概率法检验(PA-B=0.003，PB-C=0.05)，A与B组、B与C组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外，与B组相比，减少盲肠暴露时间导致模型粘连率下降77.8%，减弱损伤程度导致模型粘连率下降55.6%。见表2。

表2 实验各组大鼠盲肠-粘连模型粘连率比较

2.2 镜下观察各组大鼠粘连组织病理切片

对比A组与C组实验大鼠，B组实验大鼠盲肠-腹壁损伤部位出现大量纤维结缔组织增生，炎性细胞数目及浸润面积均高于A、C两组大鼠损伤部位。A组与C组实验大鼠损伤部位也出现炎纤维增生和炎性细胞浸润，但数目及浸润面积均不及B组，可见B组实验大鼠损伤部位炎症浸润情况最严重。对实验大鼠盲肠腹壁损伤程度的统计显示，在盲肠暴露时间均为25 min 的前提下，有88.9%的重度损伤实验大鼠盲肠与腹壁肌层受损，而在轻度损伤实验大鼠中这一比例降至33.3%。见图2及表3。

表3 盲肠暴露时间为25min的B组及C组显微镜下损伤深度观察

3 讨论

腹腔粘连是肠管、腹壁等部位损伤后组织愈合修复生理过程的一部分[6]。手术创伤等因素引发急性炎症反应导致富含纤维蛋白酶原和纤维蛋白的渗出液沉积、凝结为纤维网状物覆盖于受刺激组织表面并与周围组织发生粘合。成纤维细胞在粘合处增殖并分泌大量胶原最终导致损伤组织间的紧密粘连。正常情况下，渗出液尚有纤维蛋溶解功能，与纤维沉积形成动态平衡，从而避免组织间的严重粘连。上述平衡是否失调从而导致粘连发生主要取决于局部损伤程度及炎症反应程度[8-10]。据此以及在实际操作过程中的观察总结，本小组认为操作过程中盲肠暴露时间及盲肠-腹壁损伤程度对大鼠盲肠-腹壁粘连模型最终是否粘连有较大影响。 本研究结果显示，A组实验大鼠与B组实验大鼠同为重度损伤实验组，几乎均伤及肌层，而B组粘连率显著高于A组，导致这一结果的主要原因是B组实验大鼠盲肠暴露时间更长，组织脱水及坏死发生几率增高，并且动物实验操作环境难以做到绝对无菌，更长的暴露时间也带来了更高的细菌感染风险。以上因素均会加重实验大鼠的炎症反应，而术后组织切片HE染色结果也证实了这一点。与A组实验大鼠相比，B组实验大鼠粘连组织可见大量炎症细胞浸润及纤维沉积。C组实验大鼠与B组实验大鼠均为盲肠暴露25 min组，B组粘连率显著高于C组实验大鼠，源于B组实验大鼠损伤程度重于C组。C组实验大鼠肌层损伤率仅为33.3%，意味着大部分C组实验大鼠在造模过程中仅浆膜层受损，浆膜层具有修复快的特点，快速修复避免了炎症细胞的大量浸润[8]。C组实验大鼠损伤组织切片HE染色结果表明，与B组实验大鼠相比，受损组织并未见大量炎症细胞浸润。而B组实验大鼠大部分肌层受损，坏死的肌肉组织需要大量中性粒细胞、巨噬细胞等炎症细胞吞噬清除。在上述实验中无论是增加盲肠暴露时间还是加重损伤程度均加重了了损伤局部组织的炎症反应，导致炎症细胞的大量浸润，炎症细胞可分泌多种细胞因子刺激成纤维细胞大量增殖，分泌大量胶原蛋白从而导致纤维沉积及组织间粘连的发生[11]。因此，同时保证损伤程度达重度及盲肠暴露时间达25 min最有利于得到最终粘连率高的稳定的大鼠盲肠-腹壁粘连模型。

综上，在大鼠盲肠-腹壁粘连模型制备过程中盲肠暴露时间与盲肠-腹壁损伤程度对最终粘连率有较大影响。将大鼠盲肠、腹壁刮伤至片状出血，空气中暴露25 min，可得到粘连率达88.9%的高效稳定的大鼠盲肠-腹壁粘连模型。