心脑舒通胶囊及有效组分对原代培养大鼠星形胶质细胞的保护作用

袁 庆，胡利民，贾壮壮，殷孟兰，王少峡，郭 虹，柴丽娟

(天津中医药大学中医药研究院，天津市中药药理学重点实验室，方剂学教育部重点实验室，天津 301600)

星形胶质细胞(astrocytes，AS)是中枢神经系统的重要组成成分，在神经保护方面发挥重要作用。在缺血/再灌注等病理损伤下，AS形态和功能会发生相应变化：一方面，通过分泌炎症因子等，加重脑损伤；另一方面，激活的AS会释放大量神经营养因子，如脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等，其大量表达能支持和营养受损神经元，从而发挥神经保护作用[1]。心脑舒通胶囊是由蒺藜地上全草部分经干燥提取后制成的胶囊剂，具有活血化瘀、扶正养生、预防脑动脉硬化的药理作用[2]。相关研究表明，心脑舒通胶囊具有改善缺血/再灌注损伤大鼠脑神经功能，调节小胶质细胞及AS功能的作用[3]。但心脑舒通胶囊发挥神经保护作用是否通过促进AS神经营养因子的表达，以及其发挥药效的物质基础并未研究。本实验通过原代培养得到AS，给予氧糖剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)损伤处理，模拟脑缺血/再灌注损伤模型，探讨心脑舒通胶囊及其有效组分对损伤AS细胞活力及神经营养因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂出生1～2 d Wistar乳鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司 中心，许可证号：SCXK(京)2016-0006。心脑舒通胶囊(吉林敖东股份有限公司)；单体化合物(由天津中医药大学中医药研究院张鹏老师提供)：①原薯蓣皂苷(protodioscin)，②化合物Ⅱ-14A：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25R)-5α-呋甾-20(22-烯-3β，26-二醇-3-O-{β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷})，③化合物Ⅱ-5A：(26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-呋甾烷-4(5), 20(22)-二烯-3，12-二酮)；Cell Counting Kit-8(日本DOJINDO)；PCR试剂盒(美国Applied Biosystems)；抗GFAP、BDNF抗体(美国Cell Signaling Technology)。

1.2 方法

1.2.1AS的原代培养及鉴定 参照汤婷婷等[4]的方法，体外原代培养Wistar大鼠星形胶质细胞，略有改动，并采用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫染色法鉴定。

1.2.2细胞分组和处理 对照组：将培养液换为高糖缓冲液，正常培养4 h后，换DMEM/F12培基；模型组：将培养液换为无糖缓冲液，并放于缺氧小室内，向小室内持续充入94% N2+5% CO2+1% O2的混合气体5 min后，关闭缺氧小室，4 h后换成DMEM/F12培基；加药组：在模型组缺氧4 h后，换含药DMEM/F12培基。所有组继续正常培养20 h。

1.2.3药物对正常及损伤AS细胞增殖能力的影响 将正常培养AS上清换为含药培基，培养24 h后检测细胞增殖情况。对细胞进行“1.2.2”所述缺氧/复氧处理，复氧时加入不同浓度心脑舒通胶囊及单体，复氧20 h后加入CCK-8，检测450 nm处OD值。

1.2.4药物对AS细胞GDNF、NGF mRNA表达的影响 对细胞进行“1.2.2”所述缺氧/复氧及加药处理。复氧时，用Trozol法提取RNA，并按照SYBR GREEN PCR Master Mix试剂盒说明书进行扩增。用ABI 7500 RT-PCR仪获得每个样品反应的Ct值，并进行数据统计。引物序列如下：β-actin: F:5′-AGAGGGAAATCGTGC-3′, R: 5′-CGATAGTGATGACCT-3′；NGF：F: 5′-GGACGCAGCTTTCTATCCTGG-3′，R: 5′-CCCTCTGGGACATTGCTATCTG-3′；GDNF：F: 5′-AGCTGCCAGCCCAG AATT-3′，R: 5′-GCACCCCCGATTTTTGC-3′。所用引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.5药物对BDNF蛋白表达的影响 对细胞进行“1.2.2”所述缺氧/复氧及加药处理。复氧时裂解细胞提取蛋白，经10% SDS-PAGE电泳、转膜、封闭后，将PVDF膜置于抗BDNF、β-actin抗体中，4 ℃孵育过夜。次日加入IgG-HRP抗体后曝光，用蛋白条带的灰度值计算相应蛋白表达量，实验重复3次。

2 结果

2.1 药物对正常及损伤AS细胞增殖能力的影响如Tab 1所示，与对照组比较，心脑舒通及3个单体对AS增殖能力无明显影响(P>0.05)，提示药物对AS没有毒性。与对照组比较，模型组细胞活力明显降低(P<0.05)；与模型组比较，心脑舒通胶囊(25、50 mg·L-1)及3个单体均能明显提高受损细胞活力(P<0.05)。选取心脑舒通25 mg·L-1浓度及3个单体进行机制研究。

Tab 1 Effect of drugs on viability of normal and OGD/R treatment in AS cells n=6)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/R

2.2 药物对损伤AS细胞GDNF、NGF mRNA及BDNF蛋白表达的影响如Tab 2所示，与对照组比较，模型组能明显增加GDNF、NGF的mRNA表达，降低BDNF蛋白表达(P<0.05)；与模型组比较，心脑舒通及Ⅱ-14A均能明显增加GDNF、NGF mRNA表达及BDNF蛋白表达，Ⅱ-5A能明显诱导GDNF mRNA表达(P<0.05)。

Tab 2 Effect of drugs on GDNF and NGF mRNA and BDNF protein in OGD/R injured AS n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsOGD/R

3 讨论

本研究在心脑舒通胶囊全方的基础上，同时选取3个皂苷类活性成分进行研究，结果显示，缺氧/复氧损伤导致AS中BDNF表达明显降低[5]，而应激激活后，GDNF、NGF mRNA表达水平明显升高[6-7]。心脑舒通胶囊和化合物Ⅱ-14A能进一步诱导GDNF、NGF mRNA表达和BDNF蛋白表达，保护受损的星形胶质细胞。提示心脑舒通胶囊全方及其单体成分对胶质细胞神经营养因子的释放有促进作用，其中化合物Ⅱ-14A对神经营养因子的释放与心脑舒通胶囊具有相似的作用功效，可作为研究心脑舒通胶囊药效物质基础的候选单体药物，为心脑舒通胶囊及其有效成分的再次开发和临床应用提供实验依据。