外源ALA对NaCl胁迫下酸枣幼苗光合特性与膜脂过氧化的影响

常心怡,孙军利,赵宝龙，李芳芳，刘连玲，何 旺

(1.石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子832000;2 .新疆生产建设兵团绿洲生态农业重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】截至2017年，红枣种植面积已达50.45.67×104hm2，产量超过326×104t，位列国内各省首位[1]，枣产业在推动新疆经济发展中发挥着重要作用[2]。新疆大面积的盐碱土严重制约着红枣产业的发展，通过用酸枣作砧木来嫁接红枣以提高红枣的耐盐性[3]。酸枣(ZiziphusacidojujubaC.Y.Cheng et M.J.Liu)是鼠李科枣属植物，它具有抗旱、抗盐碱等的特点，是开发利用沙质荒地和盐碱地的优良经济树种[4]。随着新疆盐碱面积的不断增加，通过嫁接来提高耐盐性的方法面临挑战，而外源调节剂对提高枣在盐胁迫下的抗性有着重要作用。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是生物体内叶绿素和光敏素等所有卟啉化合物生物合成的关键前体[5]，以多种方式参与多种植物体内代谢过程，并对植物的生长发育具有显著的调节作用[6]。【前人研究进展】外源ALA可以调节植物叶绿素的合成和稳定，提高植物的光合效率，促进光合作用[7]，提高抗氧化能力，降低膜脂过氧化的损害程度[8]，增强植物对干旱[9]、盐碱[10]、低温[11]和弱光[12]等非生物胁迫的抗性，具有与植物激素类似的调节作用[8]。有关ALA研究表明，在NaCl胁迫下对小白菜叶片进行喷施外源ALA，可显著提高叶绿素含量，缓解NaCl胁迫对小白菜光合能力的影响[13]。外源ALA可以提高低温弱光下辣椒幼苗的抗氧化酶活性，减轻盐胁迫对细胞膜的损伤，提高辣椒的抗寒性[14]。张春平等[15]研究表明，通过喷施外源ALA 能够显著提高盐胁迫下决明子幼苗的抗氧化酶活性，并能提高决明子的光合效率，增强决明子幼苗的耐盐性。【本研究切入点】目前关于喷施外源ALA溶液可以提高植物的抗性的相关研究在番茄[16]、葡萄[17-18]和苹果[12,19]等多种植物上也有报道，但有关NaCl胁迫喷施外源ALA对酸枣幼苗叶片叶绿素含量、光合气体交换特性及抗氧化酶活性的影响有待进一步研究。研究不同浓度ALA对NaCl胁迫后酸枣幼苗叶片叶绿素含量、光合气体交换特性及膜脂过氧化的影响，【拟解决的关键问题】通过主成分分析法综合分析，筛选出缓解NaCl胁迫的最佳ALA处理浓度，研究外源 ALA 缓解酸枣幼苗的调控机制，为酸枣在盐胁迫下的生产栽培问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 酸枣与药品

酸枣种子由陕北榆林佳县提供。ALA由美国 Sigma 公司提供。

1.1.2 仪器设备

人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)，CIRAS-3型便携式光合仪，冷冻离心机，紫外分光光度计。

1.1.3 培养

试验于2015年7月到2016年10月期间在石河子大学农学院特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室进行。挑选整齐一致的酸枣种子，用清水在室温(25℃)下浸种24 h；用0.5% KMnO4给种子消毒0.5 h；整齐摆放在垫有湿润滤纸的发芽盒内；向发芽盒内加入适量蒸馏水以保持种子的湿润度，待酸枣子叶展平后每天浇灌1/2倍Hoagland营养液。当幼苗长到2片真叶的时候，选择长势整齐，大小一致的幼苗移栽定植到装有500 ml Hoagland营养液的水培盒19×13×11( cm)中，均在人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)内培养，种子发芽前采用全天黑暗，发芽后采用光照强度12 000 Lx，光照时长14 h，黑暗10 h，相对湿度保持在65%～70%；温度25～28℃，每3 d 更换1次营养液。当幼苗长到6片真叶时开始试验处理。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

采用前期预实验筛选出的用盐胁迫后酸枣表现出明显盐害症状的150 mmol/L NaCl浓度作为盐胁迫浓度，为避免酸枣幼苗产生盐激反应，NaCl浓度以每天50 mmol/L的浓度梯度递增，在同一天达到目标NaCl浓度，在酸枣幼苗叶片上喷施不同浓度梯度的ALA溶液(记作第0天)。在处理后第3 d和第6 d测定光合相关指标并进行取样，取完后放入-80℃冰箱保存样品，用于生理指标的测定。表1

表1 酸枣幼苗的不同ALA浓度组合

Table 1 Different ALA concentration combinations in Jujube seedlings

处理TreatmentNaCl浓度NaClconcentration(mmol/L)ALA浓度ALAconcentration(mg/L)CK00NaCl1500T115050T215075T3150100T4150150

1.2.2 测定指标1.2.2.1 叶绿素含量

测定方法参考植物生理试验指导书[20]。

1.2.2.2 光合气体交换参数

光合指标用CIRAS-3型便携式光合仪测定，选取自基部往上数的第5片完全叶为测定的对象，重复3次。分别于处理后第3 d、6 d上午10: 00 ～12: 00测定光合气体交换参数，测定的指标包括净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)。

1.2.2.3 抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量

精确称取0.2 g酸枣幼苗叶片，加入已预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH=7.8，含有1%PVP)进行充分研磨至匀浆状态，定容到10 mL离心管中，10 000 r/min，4℃离心15 min，上清液为SOD、POD、CAT粗提液，每个处理需重复3次。参照Li等[21]的方法测定抗氧化物酶SOD、POD、CAT的活性。丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)检测法[20]。

1.3 数据统计

采用SPSS19.0软件进行方差分析(P<0.05)，用邓肯氏法进行多重比较和差异显著性检验，并对酸枣幼苗的11个单项指标的缓解系数进行主成分分析。利用Excel2010软件进行数据的处理和作图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度ALA对NaCl处理下酸枣幼苗叶绿素含量的影响

研究表明,酸枣幼苗叶片叶绿素a(Chl a)的含量在第3 d和第6 d的各处理变化趋势相似，即均在NaCl处理下比清水对照(CK)显著降低，喷施不同浓度的ALA均能提高酸枣幼苗叶片的Chl a含量，并以T3处理增幅最大，除在第3 d的T3处理显著高于CK，其他处理均低于CK，在相同处理下，第6 d Chl a的含量均低于第3 d。其中，与CK相比，NaCl处理下酸枣幼苗叶片Chl a在第3 d和第6 d分别显著降低了36.01%和54.08%，在T3处理后分别显著增加了67.50%和105.65%。

与CK相比，酸枣幼苗叶片中叶绿素b(Chlb)含量在NaCl处理下第3 d和第6 d分别降低33.84%和40.47%；喷施不同浓度的ALA后，除在第3 dT3处理高于CK，其他处理与CK均无显著差异。与NaCl处理相比，酸枣幼苗叶片(Chl b)含量在T1～T4ALA处理后第3 d和第6 d分别显著增加了65.81%～88.95%和39.27%～82.78%，且均以T3处理最高。在相同处理条件下，酸枣幼苗叶片的叶绿素含量均表现为第3 d高于第6 d。

酸枣幼苗叶片的总叶绿素Chl含量变化趋势与Chl a趋势相似，即在NaCl处理下酸枣幼苗叶片在处理后第3 d和第6 d分别比CK降低了35.49%和50.89%，而外源ALA处理后，T1、 T2和T3处理呈上升趋势，T4处理略有下降外源ALA处理后，在T3处理下达到最大值，是NaCl处理的1.73和1.99倍，其中第3 d的值都显著比第6 d高。

研究表明,NaCl胁迫下，酸枣幼苗叶片叶绿素的含量减少，合成受阻，喷施外源ALA可缓解NaCl胁迫对酸枣幼苗叶片叶绿素含量的影响，并以T3处理缓解效果最明显，且在第3 d缓解效果较好。表2

表2 外源ALA对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶绿素含量变化

Table 2 Effects of exogenous ALA on the Chlorophyll contents of sour jujube seedlings under NaCl stress

处理时间Treatmenttime(d)处理Trement叶绿素aChlorophyllacontent(mg/g)叶绿素bChlorophyllbcontent(mg/g)总叶绿素Chlorophyllcontent(mg/g)处理后第3dDay3aftertreatmentCK18.8±0.41b5.88±0.57ab24.68±0.65bNaCl12.03±0.34d3.89±0.1b15.92±0.44cT117.38±0.55bc6.45±0.52a23.83±1.07bT217.93±0.41bc6.78±0.53a24.71±0.94bT320.15±0.88a7.35±0.89a27.5±1.27aT416.7±0.34c7.02±0.83a23.72±1.17b处理后第6dDay6aftertreatmentCK18.12±1.04a5.56±0.22ab23.68±1.34aNaCl8.32±0.33d3.31±0.49b11.63±0.82cT114.14±1.2b4.61±0.54ab18.75±1.26bT215.64±0.08bc5.21±0.12ab20.85±0.2bT317.11±0.86ab6.05±1.08a23.16±1.24aT414.2±0.53c5.97±0.18a20.17±0.71b

注: 不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。CK：清水对照; NaCl：NaCl胁迫处理；T1、T2、T3和T4分别表示50、75、100与150 mg/L ALA浓度。下同

Note: Different letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.CK: Clean water control.NaCl: NaCl stress treatment.T1, T2, T3 and T4 indicate 50, 75, 100 and 150 mg/L ALA concentration, respectively.The same as following

2.2 不同浓度ALA对NaCl处理下酸枣幼苗光合参数的影响

研究表明,与CK相比， NaCl处理下酸枣幼苗叶片中的净光合速率、气孔导度和蒸腾速率在第3 d和第6 d显著下降，分别降低了65.00%和71.67%、68.75%和75.60%及57.07%和80.51%；胞间CO2浓度显著升高，分别提高了24.08%和34.45%。经不同浓度的ALA处理后，与NaCl处理相比，各浓度外源ALA处理酸枣幼苗叶片Pn、Gs和Tr在第3 d和第6 d均呈先增加后减少的趋势；Ci呈先减少后增加的趋势。其中，以ALA处理后第3 d的T3处理的效果最佳，分别增加了85.71%、135%和87.06%；Ci降低了22.53%。可见，盐胁迫显著影响了酸枣幼苗的光合作用效率，外源ALA可以显著缓解盐胁迫的伤害，并以T3处理效果最好。随着处理时间的延长，ALA的缓解效果减弱。图1

图1 外源ALA对NaCl胁迫下酸枣幼苗光合参数变化

Fig.1 Effects of exogenous ALA on photosynthetic parameters in sour jujube seedlings under NaCl stress

2.3 不同浓度ALA对NaCl处理下酸枣幼苗抗氧化酶和丙二醛(MDA)含量的影响

研究表明,酸枣幼苗叶片中SOD在NaCl处理下第6 d显著第与CK，而第3 d则与CK无显著差异。喷施不同浓度的ALA后，均能不同程度的提高盐胁迫下SOD活性；其中，在相同处理下，第3 d的盐胁迫下酸枣幼苗叶片中SOD活性均高于第6 d，T1与T3间差异显著，其他处理间差异不显著。在第3 d，T3处理比NaCl处理显著提高了20.79%。

酸枣幼苗叶片中POD活性在NaCl处理第6 d显著比CK低18.91%，而第3 d则无显著差异。不同浓度ALA处理酸枣幼苗叶片中POD活性大多比NaCl处理不同程度升高。其中，T1处理在第3 d酸枣幼苗叶片中POD活性显著升高23.76%，T2处理在第3 d和第6 d分别显著提高31.99%和24.20%，T3处理在第3 d和第6 d分别显著升高69.59%和67.63%，T4处理在第3 d和第6 d分别显著升高18.33%和26.43%。

NaCl处理下酸枣幼苗叶片中CAT活性与CK相比无显著差异。与NaCl处理相比，喷施不同浓度ALA后，第3 d和第6 d分别增加了18.81%～61.25%和25.73%～51.46%，且均以T3处理最高。第3 d的增幅最大，且相同处理下第3 d的CAT活性均高于第6 d。

酸枣幼苗叶片中MDA在NaCl处理下第3 d和第6 d显著比CK高82.04%和123.34%，与NaCl处理相比，外源ALA能显著降低酸枣叶片MDA含量，以T3处理降低幅度最大，分别在第3 d和第6 d降低了24.71%和38.50%，第6 d的变化幅度最显著。在相同处理条件下，外源ALA处理后第3 d的MDA含量均低于第6 d。

第3 d NaCl胁迫对酸枣幼苗SOD和POD活性无显著影响，第6 d胁迫则诱导抗氧化酶活性显著下降和MDA含量显著提高，而外源喷施ALA显著增强NaCl处理下抗氧化酶活性，降低其MDA含量，有效缓解NaCl胁迫诱发的过氧化伤害，并以T3处理缓解效果最佳，高于T3浓度反而削弱这种缓解效应。图2

图2 外源ALA对NaCl胁迫下酸枣幼苗叶片SOD、POD、CAT活性及MDA含量

Fig.2 Effects of exogenous ALA on POD, SOD, CAT activities and MDA contents in the leaves of sour jujube seedlings under NaCl Stress

2.4 不同浓度ALA对NaCl处理下酸枣幼苗耐盐性的综合评价

研究表明,根据特征值>1作为主成分个数原则，第1、第2主成分特征值分别6.952和3.5832，累计百分率达到95.78%，已对酸枣11个变量指标做了充分的概括，提取2个主成分。表3

表3 各指标筛选主成分

Table 3 Principal component analysis for indexes screening

主成分Principalcomponent特征值Eigenvalue百分率Proportion(%)累计百分率Cumulative(%)16.95263.200363.200323.583232.574795.7751

研究表明，第1主成分对Chl a、Chl b、Chl、Tr和Gs等有较大的得分系数，第1主成分主要是叶绿素含量决定；第 2 主成分的SOD、CAT和POD等有较大的得分系数，即第2主成分主要代表了抗氧化酶活性。综合2个主成分所携带的信息，可以用Chl a、Chl、SOD和CAT 4个指标来概括11个指标中的大多数信息。各指标均有较高载荷，能够较好地代表原始数据所反映的信息。

为了能够更加直观的评价外源ALA对酸枣幼苗耐盐性的影响，根据主成分值进行排序，即对不同浓度ALA处理下酸枣幼苗的耐盐性进行综合评价，综合指数越高，其浓度能更好地提高植株耐盐性。设变量叶绿素a、叶绿素总量、叶绿素b、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、气孔导度、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和丙二醛的标准化后数据依次为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10和X11，则得到主成分表达式：Y1=0.37X1+0.37X2+0.32X3+0.28X4+0.32X5+0.34X6-0.37X7+0.16X8+0.22X9+0.17X10-0.29X11；Y2=0.04X1+0.1X2+0.23X3-0.35X4-0.28X5-0.24X6-0.01X7+0.47X8+0.38X9-0.45X10+0.33X11；进行耐盐性综合评价时，可选取2个主成分，以每个主成分的方差贡献率作为权重，构造综合评价指数：F综=0.632Y1+0.326Y2。表4

表4 主成分因子得分系数

Table 4 Component score confficient

指标Indexes第1主成分Component1第2主成分Component2叶绿素aChla0.9880370.068518叶绿素总量Chl0.9771870.187293叶绿素bChlb0.8531880.432595净光合速率Pn0.745919-0.656436气孔导度Gs0.834882-0.529199蒸腾速率Tr0.889014-0.453156气孔导度Ci-0.97199-0.017667超氧化物歧化酶SOD0.4138130.895724过氧化物酶POD0.5798330.726871过氧化氢酶CAT0.4582090.84472丙二醛MDA-0.7661950.628865

得分由大到小依次为：T3>T2>T4>T1>CK>NaCl，其中外源ALA在T3处理下酸枣幼苗的耐盐性最强。表5

表5 不同浓度ALA处理下酸枣幼苗耐盐能力的综合评价Table.5 Comprehensive evaluation of salt resistance of sour jujube seedlings under different ALA concentration treatments using principal component analysis

处理TreatmentF1ScoreofPC1F2ScoreofPC2F综合Generalscore排序SortCK1.843-3.606-0.0115NaCl-4.860-0.392-3.1996T1-0.4380.8780.0094T20.6851.0650.7802T32.6601.6352.2141T40.1110.4210.2073

3 讨 论

植物受盐胁迫后，膜系统结构破坏，蛋白质合成能力及叶绿素的合成速率降低，致使叶绿素含量减少，光合能力减弱[22]。叶绿素是植物光合作用的主要因子，参与光能的吸收、传递和转化[23]。前人研究中 ALA 是植物体内叶绿素生物合成前体[24-25]，低浓度ALA使得盐胁迫下葡萄叶片能够保持较高的叶绿素含量和光合速率[17]。研究表明，在150 mmol/L NaCl处理下叶片中的Chl a、Chl b和Chl的含量显著降低，喷施不同浓度的ALA后，酸枣幼苗Chl a 、Chl b和Chl的含量均能不同程度的提高，且喷施ALA后第3 d和第6 d的变化趋势相似。这与常青山[26]的研究结果一致。酸枣幼苗在NaCl胁迫下叶绿素分解，Chl a、Chl b和Chl含量下降，而喷施外源ALA缓解了NaCl胁迫对叶片中叶绿体膜及其结构完整性的损害，抑制了酸枣幼苗叶片中叶绿素分解的速度，维持了酸枣的光合速率的稳定，有效地缓解了NaCl胁迫对酸枣幼苗的影响。原因可能是由于ALA是叶绿素生物合成的前体物质，喷施外源ALA可以通过促进胆色素原 (porphobilinogen, PBG) 和尿卟啉原Ⅲ (uroorphyrinogenⅢ, UROⅢ) 等中间产物向下游转化，促进叶绿素的合成[27]，试验研究结果与之一致。

在盐胁迫条件下植物的光合作用受到气孔因素和非气孔因素等多种因素的共同作用而被抑制[28]，当Ci与Gs具有同样的下降趋势时，Pn主要由于气孔因素导致下降；当Ci增加而Gs减少时，则是由非气孔因素引起Pn下降[29]。张春平[30]研究表明黄连幼苗叶片处在盐胁迫条件时，盐胁迫导致叶肉细胞光合活性的减弱，因此非气孔限制因素是盐胁迫下植物叶片光合作用降低主要因素，而外源ALA处理可以缓解盐胁迫对黄连幼苗叶片光合作用的非气孔限制，维持光系统的较高活性。研究结果表明，NaCl胁迫导致酸枣幼苗叶片Gs逐渐下降，Ci逐渐升高，说明盐胁迫光合作用的主要限制因素是非气孔因素。喷施外源 AIA减缓了NaCl胁迫下酸枣幼苗叶片Pn、Gs和Tr的降幅，Ci的增幅也显著降低，表明ALA可以缓解NaCl胁迫对酸枣幼苗叶片光合作用的非气孔限制，有助于调节植物叶片的气孔正常开闭，从而促进CO2的交换，增强CO2同化能力，提高光合速率，维持光系统的稳定，这与常年春等[31]的研究结果一致。同时，研究还发现在100 mg/L ALA处理效果最好，处理前期(第3 d)缓解效果显著，处理后期(第6 d)效果减弱。

植物通过把O2还原成H2O，为植物生长提供所需能量。但植株在长时间逆境作用时，O2不能被完全还原成H2O，导致植物体内积累大量活性氧，活性氧过量会引起膜脂过氧化，MDA积累量增加。此时植物细胞内的SOD就开始催化O2-转变为H2O2，而后CAT和POD将H2O2分解为H2O和O2[32]，阻止膜脂过氧化作用持续发生。董荣荣等[33]认为亚适宜温光下ALA可提高黄瓜幼苗中CAT、SOD和POD活性，并降低MDA含量。Poulos等[34-35]认为这可能与ALA转化为有关，喷施ALA能促进亚铁血红素合成，增加过氧化物酶活性，从而提高植物对氧化胁迫的抗性，这与实验的研究结果一致。试验中，NaCl胁迫下，ALA处理后第3 d酸枣幼苗叶片SOD、POD和 CAT活性均高于CK，MDA含量增幅降低。外源ALA可显著提高NaCl胁迫下的抗氧化酶酶活性，减少膜脂质过氧化程度，保持膜系统的完整性，增强植株抵御逆境的能力。

4 结 论

喷施不同浓度的ALA均会显著缓解NaCl胁迫下酸枣幼苗叶绿素含量、Pn、Gs、Tr、SOD、POD和CAT的降低速度，能够显著降低Ci和MDA含量增加的速度。外源ALA处理后酸枣耐盐性由强到弱为：T3>T2>T4>T1>CK>NaCl，即100 mg/LALA处理下能有效缓解盐胁迫下酸枣幼苗光合特性和抗氧化酶的活性，并且处理后第3 d缓解效果优于第6 d。叶绿素a、叶绿素总量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)可以作为评价外源ALA对NaCl胁迫缓解效应的主要指标。