大蒜素对胃癌细胞化疗增敏机制研究

王浩冉,潘元明,张 玲

王浩冉,内蒙古科技大学包头医学院中心临床学院消化内科 内蒙古自治区包头市 014040

潘元明,中国人民解放军总医院第七医学中心消化内科 北京市100700

张玲,内蒙古自治区包头市中心医院消化内科 内蒙古自治区包头市014040

核心提要： 目前大量研究发现大蒜素(diallyl trisulfide,DATS)对胃癌细胞(gastric cancer cells,GCC)的增殖、分化有一定的抑制作用,但具体作用机制尚不清楚.本研究使用胃癌BGC823细胞系,采用流式细胞术、Western blotting等方法发现DATS对GCC的多西紫杉醇化疗有增敏作用且与细胞周期蛋白B1的表达有关.

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是最常见的恶性肿瘤之一,根据国际癌症研究机构的统计数据,我国的GC发病和死亡例数均约占世界的50%[1,2],一般到典型临床症状出现的时候,疾病已经发展到进展期[3],因此GC严重威胁着我国人民群众的健康.对于进展期GC的综合治疗中化疗仍是重要的方式,其中多西紫杉醇(docetaxel,DOC)是应用最广泛的紫杉烷类化疗药物,主要作用在细胞微管系统,与微管的β-tubinlin 结合,抑制微管解聚[4-6],并可特异性作用于细胞周期的M期,通过阻断细胞周期中的M期,使细胞不能分化,从而发挥其抗肿瘤作用[7],但DOC的毒性比紫杉醇大,而且经常与其他化疗药物一起使用,化疗药物的毒副作用和耐药性一直是进展期肿瘤治疗领域中的热点、难点问题[8],如何利用天然化合物来增加化疗药物的敏感性及降低毒性作用是一种潜在的治疗策略.既往研究提示大蒜素(diallyl trisulfide,DATS)具有抗癌和抑癌作用[9,10],DATS是大蒜中主要的生物活性物质,1944年,曾有人首次在实验室中分离并研究了蒜氨酸[11],蒜氨酸是由蒜氨酸上的蒜氨酸酶(S-烯丙基-半胱氨酸亚砜)形成的,蒜氨酸具有手性,仅作为外消旋酶存在,当大蒜粉碎时,蒜素与蒜氨酸酶相互作用,形成大蒜素,它是大蒜中存在的一种含硫化合物的特有成分,是多种含硫化合物的复合体,有大量研究发现DATS能够抑制包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤细胞的增殖[12,13],近年来部分研究提示DATS可以抑制胃癌细胞(gastric cancer cells,GCC)的增殖,本课题组的前期试验证实DATS可以阻止细胞进入有丝分裂期,发生G2/M期阻滞,因此可以起到抑制细胞增殖的作用.

真核细胞的细胞周期分为G0/G1期、S期和G2/M期,质量控制检查点的失败或调控分子的失衡,包括周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)和CDK抑制剂,在癌症的发展中起着重要作用[14,15].细胞周期蛋白B1(cyclinB1,CCNB1)是一种重要的细胞周期调节蛋白,特别是CCNB1和CDK2是有丝分裂促进因子的组成部分,是G2-M转化的关键角色[16-19].CDK2的表达水平在整个细胞周期中通常是恒定的,而CCNB1的表达是循环的,并在G2-M转变时达到峰值[16,20].另外有研究发现半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase-3)在细胞凋亡中发挥着重要作用,与真核细胞的凋亡密切相关,在细胞凋亡的级联反应过程中,Caspase-3是细胞凋亡的执行蛋白,参与多种因素诱导的细胞凋亡,是级联反应中最关键的效应蛋白酶,在凋亡的病理过程中发挥重要作用[21].因此本研究通过体外培养人BGC823细胞并给予DATS+DOC联合作用,观察DATS对BGC823细胞对DOC化疗敏感性的作用,并初步探讨了CCNB1是否参与了DATS对GCC的化疗敏感性的作用,为临床上进展期GC的化疗提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料 细胞株人胃腺癌细胞株BGC-823细胞(购自上海图赫实业公司),BGC823细胞培养于1640细胞培养基(美国Gibco公司)； 多西紫杉醇(杭州赛诺菲制药公司,批号： J20150083)； 大蒜素注射液(购自上海禾丰制药公司,批号： H31022371),兔抗人FHIT单克隆抗体(Abcam公司),辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥公司)； 兔抗caspase-3单克隆抗体(北京百奥莱博科技公司)； 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI溶液)(DAKE公司),PBS缓冲液(美国Gibco公司)； 碘化丙啶(propidium iodide,PI)(北京百奥莱博科技公司)； 诺考达唑(武汉欣欣佳丽生物科技公司)； β-actin单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)； SDS-PAGE试剂(Sigma公司)； RIPA蛋白裂解液(Beyo time公司)； Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒(碧波公司)； 蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物公司)； ECL超敏发光液(北京普利莱公司)； Cell Analyzer CA-Ⅱ型流式细胞仪(德国Partec公司)； Multicycle 流式细胞仪细胞(美国Phoenix Flow Systems公司)； BX43型光学显微镜(日本Olympus公司)； ChemDoc XRS型化学发光成像仪(美国Bio-red公司)； 5804R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)； Odyssey凝胶成像系统(美国Li-COR公司).

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术检测BGC823细胞周期分析： 取对数生长期的BGC823细胞,按1×106cells/mL以1 mL加至24孔板,再加入1 mL/孔的0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L浓度的DATS,每组分别作用0 h、12 h、24 h、48 h、72 h,37 ℃培养后收获,用PBS缓冲液(0.01 mol/L,pH7.4)洗涤,离心弃上清,沉淀的细胞在不断振荡下逐滴加入1 mL无水乙醇进行固定,置4 ℃保存待测.然后用将固定的细胞离心,弃乙醇,用PBS洗涤,将细胞悬浮于1 mL预处理液(2.1%柠檬酸,0.5% Tween 20)中,37 ℃水浴轻摇10 min,然后加入DAPI染液,4 ℃避光孵育30 min以上,并用流式细胞仪进行检测.检测结果用专用分析软件进行细胞周期分析.

1.2.2 DATS与DOC单独及联合作用对BGC823细胞凋亡的影响： 各组细胞经胰酶消化,4 ℃离心5 min收集细胞,用预冷的PBS洗涤溶液洗涤2次后,制备浓度约1×105的单细胞混悬液,加入100 μL缓冲液,再加入5 μL A nnexin V-FITC和5 μL PI混匀,避光室温孵育10 min后,分别加入400 μL缓冲液并混匀后1 h内通过流式细胞仪检测并分析细胞凋亡情况.

1.2.3 Western blotting法检测CCNB1蛋白的表达水平： 收集各组细胞,加入RIPA蛋白裂解液,4 ℃ 12000 g离心20 min,取上清,BCA蛋白定量试剂盒检测各组细胞总蛋白浓度,蛋白样品与5×上样缓冲液按4：1比例涡旋均匀,煮沸10 min,冷却至室温后,-20 ℃保存备用.等量蛋白SDS-PAGE电泳分离蛋白,80 V恒压电泳30 min,换电压为120 V,继续电泳150 min左右,依据蛋白分子大小而定.将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉的TBST液(Tris-缓冲盐溶液)封闭1 h,洗膜后加入按照1：1000稀释的兔抗人FHIT多克隆抗体,4 ℃孵育摇床过夜.TBST充分洗膜,10 min/次,洗3次.洗膜后,用1：3000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体、caspase-3(1：1000)一抗溶液,室温条件下孵育1 h,TBST充分洗膜,10 min/次,洗3次,使用ECL显色,按照说明书进行显色、曝光、显影、定影,同样方法,以β-actn(1：56000稀释)作为内参照.通过Odyssey凝胶成像系统对实验结果进行拍照记录,并进行蛋白条带灰度分析.

统计学处理均运用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计量资料以mean±SD表示,组间均数两两比较采用t检验,统计分析采用单因素方差分析或双因素方差分析及重复测量设计的方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 DATS对BGC823细胞的细胞周期各时相的影响BGC823细胞的细胞周期经DATS处理后均发生了明显的变化,与空白对照组相比主要表现为G1期细胞减少,G2/M期细胞增多,表明BGC823细胞经DATS处理后细胞周期阻滞于G2/M期,且大蒜素浓度为25 μmol/L、作用时间为12 h时对BGC823细胞的抑制作用最明显(图1).在实验中进一步运用免疫荧光和流式细胞术对DATS作用后的BGC823细胞进行分析,发现DATS作用于BGC823细胞后,细胞内出现CCNB1的累积现象,对BGC823细胞进行同步化处理后再次使用25 μmol/L DATS作用于BGC823细胞结果DATS组的CCNB1的蛋白表达水平升高(图2,3).同时也证实DATS处理后引起了细胞中期阻滞和凋亡的增加.

2.2 DATS与DOC单独及联合作用对BGC823细胞凋亡的影响 DATS组、DOC组和联合组细胞凋亡率均显著高于空白对照组(P＜0.05),且DATS+DOC联合组显著高于DOC组(P＜0.05)(图4).

2.3 DATS与DOC单独及联合作用对BGC823细胞周期的影响 DATS组、DOC组和联合组BGC823细胞周期G2/M期比例显著高于空白对照组(P＜0.05)； DOC组和联合组BGC823细胞周期G1期比例显著低于空白对照组(P＜0.05)； 联合组胃癌BGC823细胞周期G1期比例显著低于DATS组和DOC组(P＜0.05)； G2/M期比例显著高于DATS组和DOC组(P＜0.05)(图5).

2.4 DATS与DOC单独及联合作用CCNB1表达情况Western blotting结果显示各组分别给药后胃癌BGC823细胞中CCNB1表达在联合给药后表达显著增加,活化型caspase-3表达增加(图6).

3 讨论

GC是消化道恶性肿瘤中最常见的肿瘤之一,可在任何年龄段发病,40-60岁之间居多,GC的病因不明,可能与饮食、生活方式、环境因素、遗传、心理因素和幽门螺杆菌感染等许多因素有关[22,23].目前早期GC的治疗多通过手术方式进行治疗,而进展期GC,除手术治疗外还需要更多的综合治疗,目前进展期GC的一线化疗大多是多种细胞毒性药物[24],且单一化疗的效果有限,需要研究新的更为有效的化疗药物或化疗方案.本课题研究了DATS对BGC823细胞的抑制肿瘤细胞增殖的作用效果,并探讨了DATS对GCC化疗药物DOC的增敏作用及其作用机制.

DATS是大蒜粉碎后加水蒸馏而得到的大蒜挥发油,其主要成分为二烯丙三硫[25,26],具有天然性和低毒性的特点,已有研究发现,较低浓度的DATS即可抑制肿瘤细胞迁移,诱导细胞凋亡[27,28].目前有大量研究表明DATS对多种肿瘤细胞的生长、增殖、分化有一定的抑制作用[13,29-31],本实验已证实不同浓度的DATS作用于BGC823细胞后,细胞凋亡率测定结果显示,DATS浓度为25 μmol/L、作用时间为12 h时肿瘤细胞中期阻滞和凋亡增加,DATS作用于培养细胞后,流式细胞仪检测及光镜下的形态学观察结果显示,细胞周期大多被阻滞于M期,同时可以促进CCNB1的累积.

在临床上DATS作为治疗恶性肿瘤的辅助用药已经得到广泛的应用,Gao等[32]研究证明联合应用DATS后可以增强化疗药物环磷酰胺的药物作用,明显降低肿瘤的生长.谢军等[33]研究也发现,DATS联合环磷酰胺对肿瘤细胞增值抑制作用明显高于单一环磷酰胺用药组.另外,有研究发现DATS具有增强化疗药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导肝癌细胞的细胞毒性[10].因此,联合应用DATS对化疗药物的增敏作用在少许实验中已经证实,本实验通过DATS与DOC单独或联合作用检测对BGC823细胞凋亡及细胞周期的结果显示： 与单用DOC组比较,联合组能够更加显著的将胃癌BGC823细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞有丝分裂,显著提高BGC823细胞凋亡率,提示DATS能够增强胃癌BGC823细胞对DOC化疗敏感性,即DATS对BGC823有化疗增敏作用.进一步我们应用Western blotting检测DATS作用前后CCNB1表达的变化,结果显示,空白对照组、DATS组、DOC组中CCNB1表达量少,DATS+DOC组的CCNB1表达较前3组明显表达增多,表明DATS都能够促进GCC的调亡,且两者具有协同作用,这种促凋亡作用可能与CCNB1过表达相关,其具体机制有待于进一步阐明.

综上所述,DATS可增强BGC823细胞对DOC化疗敏感性,可能与诱导CCNB1的蛋白的表达增加有关,具体机制需进一步研究.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer,GC)是全球常见的恶性肿瘤,晚期患者预后相对较差,而进展期GC的治疗多通过手术或联合辅助化疗进行治疗,目前临床中GC的化疗药物多种多样,其中多西紫杉醇(docetaxel,DOC)是最常见的化疗药物之一.DOC为新一代紫杉醇类衍生物,可特异性作用于细胞周期的M期,通过阻断细胞周期中的M期,使细胞不能分化,从而发挥其抗肿瘤作用,近年来部分研究提示大蒜素(diallyl trisulfide,DATS)可以抑制胃癌细胞(gastric cancer cells,GCC)的增殖,发生G2/M期阻滞,因此可以起到抑制细胞增殖的作用.目前DOC的临床应用受耐药性的限制,寻找耐药辅助增敏的研究倍受关注,因此拟通过本课题研究探讨DATS对GCC化疗增敏的分子生物学机制.

图1 DATS促进胃癌细胞BGC823发生中期阻滞.A: 25 μmol/L DATS处理BGC823胃癌细胞不同时间段,观察细胞周期的变化； B: 以不同DATS浓度分别处理BGC823 12 h.DATS: 大蒜素.

图2 DATS诱导cyclinB1表达增加.A: 用DATS、阳性对照诺考达唑中期阻滞药及生理盐水分别处理BGC823细胞,CCNB1免疫荧光染色情况,DAPI染色显示细胞核(蓝色)； B: 用DATS、阳性对照诺考达唑中期阻滞药及生理盐水分别处理BGC823细胞后,流式细胞仪分析细胞周期结果表示细胞在G2/M期阶段的百分比.cyclinB1: 细胞周期蛋白B1； DATS: 大蒜素.

图3 DATS对中期同步化与非同步化的胃癌细胞凋亡比例的影响.A: 对照组细胞的凋亡比例仅为4.8%(平均)； B: 加入DATS 12 h后,凋亡比例为17.2%(平均)； C: 当通过中期同步化技术,细胞的凋亡比例为7%(平均)； D: 通过在同步化的基础上,加入DATS处理12 h,凋亡细胞的比例为24.5%(平均),提示DATS处理后引起细胞中期阻滞和凋亡增加.DATS: 大蒜素.

图4 各组胃癌BGC823细胞凋亡情况.A: 用DATS和/或DOC处理BGC823细胞后,细胞凋亡的代表性分析； B: 定量,数据以mean±SD表示,aP＜0.05,bP＜0.01,与对照组比较有显著性差异.DATS: 大蒜素； DOC: 多西紫杉醇.

实验动机

本研究拟通过实验研究验证DATS是否可以增加GCC对于化疗药物DOC的敏感性,明确细胞周期蛋白B1(cyclinB1,CCNB1)是否参与DATS抑制GCC增殖的作用,为临床肿瘤化疗提供新的思路.

实验目标

明确DATS抑制GCC增殖的作用机制.明确DATS是否对DOC对GCC的化疗作用有增敏作用.明确CCNB1是否参与了DATS 对GCC的化疗敏感作用.

实验方法

从胃癌系中筛选出CCNB1表达阳性的BGC823 GCC,然后细胞培养,选择对数生长的细胞接种于培养瓶随机分成对照组和实验组,利用流式细胞术、细胞凋亡、细胞周期分析等,检测细胞周期分布比例变化.设立空白对照组、加入DATS组、加入DOC组及加入DATS+DOC组,应用流式细胞术实验方法检测DATS单独或联合DOC后BGC-823的增殖及细胞凋亡情况.应用蛋白质印迹法检测上述各实验组分别给药后CCNB1的表达情况,并应用免疫荧光与流式细胞术对比中期阻滞药诺考达唑处理后的BGC823细胞与富集大蒜素(DATS)诱导后的中期BGC823细胞中CCNB1的表达.

图5 各组胃癌BGC823细胞周期的比例分布情况.A: 用DATS和/或DOC处理BGC823细胞后,细胞周期分布的代表性分析； B: 定量,数据以mean±SD表示,aP＜0.05,bP＜0.01,与对照组比较有显著性差异.DATS: 大蒜素； DOC: 多西紫杉醇.

图6 各组胃癌BGC823细胞中CCNB1表达情况.Western blotting结果提示大蒜素和多西紫杉醇单一或者联合给药后CCNB1和a-caspase-3表达水平.DATS: 大蒜素； DOC: 多西紫杉醇； CCNB1: 细胞周期蛋白B1； a-caspase-3: 活化型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶.

实验结果

DATS可增强DOC对BGC823细胞的化疗敏感性,且与诱导CCNB1的蛋白的表达增加有关,为DATS在抑制肿瘤细胞增殖作用及抗癌机制提供理论依据,且初步验证CCNB1参与DATS抑制肿瘤细胞增殖的作用.

实验结论

我们研究结果发现,DATS可以明显抑制GCC增殖,增加DOC的化疗敏感性,其机制与诱导CCNB1的蛋白表达增加有关.

展望前景

本研究首次通过实验研究验证DATS可以增加GCC疗药物DOC的敏感性,初步证实DATS对化疗药物DOC的增敏作用与CCNB1的过表达有关,后期将继续进一步探讨CCNB1表达调控的分子机制,为临床表观遗传学干预治疗提供新的理论基础.