基于阳离子表面活性剂/核酸适配体的超分子组装体荧光检测Hg(Ⅱ)的研究

高 菲， 贾 兰， 陈 松

(太原理工大学材料学院，山西太原 030024)

汞是在生态系统中唯一能完善循环的重金属。汞具有高迁移、不可降解及生物富集性等特性，因此微量的汞也会对生态环境造成严重的危害[1]。汞与其化合物可通过人体的皮肤、消化道或者呼吸道进入人体，对口、粘膜和牙齿都有不良影响，严重破坏人体的中枢神经系统，长时间暴露在高汞环境中甚至可以导致脑损伤及死亡[2]。汞以多种形式存在于环境中，水环境中的Hg(Ⅱ)是最常见的形式，而汞中毒一般也由Hg(Ⅱ)引起，Hg(Ⅱ)会与人体中的巯基络合形成金属蛋白，抑制酶的活性，损害人体的肝功能，从而导致肾衰竭。因此，检测生物体及水环境中微量Hg(Ⅱ)成为近年来的重要研究领域[3 - 4]。核酸适配体是一段脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列，它是利用体外筛选技术(SELEX)[5]从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体可以与目标物高选择性、高特异性结合。研究发现，Hg(Ⅱ)能够与碱基胸腺嘧啶T特异性结合，形成稳定的“T-Hg(Ⅱ)-T”发夹状结构，基于这种结构的检测体系已有报道[6 - 9]。表面活性剂中加入带相反电荷的聚电解质，在低于表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)条件下，可通过静电作用和疏水作用形成类胶束组装体[10]。

荧光光谱法具有简便快捷、高灵敏度和高选择性、实时监测以及成本低等优点[11]。本研究利用带正电的阳离子表面活性剂十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)与带负电的Hg(Ⅱ)核酸适配体，通过静电和疏水作用结合为组装体。当加入Hg(Ⅱ)后，Hg(Ⅱ)能够与碱基胸腺嘧啶T特异性结合，形成稳定的“T-Hg(Ⅱ)-T”发夹状结构，将会诱导其解组装。利用尼罗红在水环境与疏水腔中不同荧光强度的性质构造“荧光关”的Hg(Ⅱ) 的检测体系。图1为其检测Hg(Ⅱ)的原理示意图。

图1 DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红组装与加入Hg(Ⅱ)后解组装示意图Fig.1 Scheme of the DTAB/Hg(Ⅱ) Aptamer/NR assembly and Hg(Ⅱ) induced disassembly

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

FLUOROMAX-4荧光光谱仪(美国，HORIBA);JFM-1011透射电镜(TEM)(日本，JEOL)；JK99B全自动张力仪(上海中晨数字技术设备有限公司)；SB-100D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；H/T16MM台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)。

十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)(99%，阿拉丁试剂(上海)有限公司)；Hg(Ⅱ)核酸适配体(5′-TTCTTTCTTCCCTTGTTTGTT-3′)(HAP纯化，生工生物工程(上海)股份有限公司)；高氯酸汞(99%+，Strem Chemicals,Inc.美国)；尼罗红(NR)(≥95%，阿拉丁试剂(上海)有限公司)。实验用水由XYA2-50-H纯水机制备。

1.2 实验方法

1.2.1 DTAB临界胶束浓度的确定配制浓度为1.0×10-4mol·L-1尼罗红的丙酮溶液，同时配制浓度1.0×10-5～1.0 mol·L-1的系列DTAB溶液，各取2 mL于离心管中，分别加入20 μL的1.0×10-4mol·L-1尼罗红的丙酮溶液(尼罗红终浓度为1.0×10-6mol·L-1)。涡旋振荡混匀后，将含有尼罗红的DTAB溶液敞口超声处理30 min，静置1 h，测量荧光发射光谱。

1.2.2 Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度的确定配制浓度为1.0×10-3～10 μmol·L-1的系列Hg(Ⅱ)核酸适配体溶液，分别加入一定量的DTAB溶液(DTAB终浓度为5.0×10-4mol·L-1)，各取2 mL置于离心管中，分别加入20 μL的1.0×10-4mol·L-1尼罗红的丙酮溶液，混匀，敞口超声处理后，进行荧光光谱测量。

1.2.3 超分子组装体的表征荧光光谱在FLUOROMAX-4(HORIBA，美国)荧光光谱仪上测试。测试条件：电压750 V，固定激发波长为545 nm，测定发射波长范围为565～800 nm，狭缝宽度为10/10 nm。

透射电镜(TEM)测试在JEM-1011(JEOL，JAPAN)透射电子显微镜上进行，电流加速电压为80 kV。制样时，对样品进行负染色，用微量注射器将溶液悬滴到铜网上静置数分钟，然后用磷钨酸钠染色液浸泡数分钟，再用滤纸吸去多余的液体，待干后用于电镜观察。

表面张力是在JK99B(铂金板法)全自动张力仪(上海中晨数字技术设备有限公司)上进行测定。

2 结果与讨论

2.1 DTAB的临界胶束浓度

本实验采用荧光谱法[12]测定DTAB的CMC值。图2为发射波长为638 nm时，DTAB/尼罗红溶液体系中DTAB浓度对数的荧光光谱图，可以看出当DTAB的浓度低于某一值时，体系的荧光强度基本无变化，随着DTAB的浓度增加，体系的荧光强度逐渐增强，并产生一个拐点，在拐点处做两条切线，切线位置对应浓度即为DTAB的CMC值，用荧光法测得的CMC值为9.2 mmol·L-1。

2.2 Hg(Ⅱ)核酸适配体的最佳浓度

Hg(Ⅱ)核酸适配体是通过SELEX从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。图3是发射波长在638 nm处，在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液体系中Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度的荧光强度。可以看出当Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度很小时，体系荧光强度基本保持不变，这是因为Hg(Ⅱ)核酸适配体的浓度过小，不足以与DTAB形成组装体；当Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度超过0.1 μmol·L-1时，体系的荧光强度开始增强，此时体系中带正电的表面活性剂DTAB与带负电的Hg(Ⅱ)核酸适配体通过静电与疏水作用结合，形成超分子组装体，荧光探针尼罗红进入组装体的疏水腔中，从而产生荧光强度的变化；而当Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度大于5 μmol·L-1时，体系荧光强度增长趋于平缓，此时DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红超分子组装体基本完全形成。为了保障后续实验中形成DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红超分子组装体，实验选用的Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度为5.0 μmol·L-1。组装体中DTAB浓度为5.0×10-4mol·L-1，尼罗红的浓度为1.0×10-6mol·L-1。

图2 DTAB/尼罗红溶液中DTAB浓度对数的荧光强度Fig.2 Fluorescence intensity of the logarithm concentration of DTAB in DTAB/NR solutions

图3 DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液体系中Hg(Ⅱ)核酸适配体浓度的荧光强度Fig.3 Fluorescence intensity of Hg(Ⅱ) aptamer concentration in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions

2.3 超分子组装体的表征

为了观察DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液形成的组装体，以及加入Hg(Ⅱ) 后组装体解离，分别对其用透射电镜(TEM)进行表征。图4(a)为DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液的TEM；图4(b)为加入1.0×10-4mol·L-1Hg(Ⅱ)的DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液的TEM。可以看出，图4(a)中存在较为规则且分布均匀的圆形胶束，在加入Hg(Ⅱ)后(图4(b))基本不存在胶束。说明DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红组装体已经完全解体。

图4 (a)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液的透射电镜(TEM)图；(b)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液中加入1.0×10-4 mol·L-1Hg(Ⅱ)的TEM图Fig.4 (a)TEM image of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions;(b)TEM image of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions with 1.0×10-4 mol·L-1 Hg(Ⅱ)

图5 (a)不同浓度Hg(Ⅱ)在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液中的荧光光谱图；(b)荧光猝灭效率与加入Hg(Ⅱ) 浓度的关系(插图对应的是线性检测图)Fig.5 (a)Fluorescence spectra of different concentration of Hg(Ⅱ) in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions;(b)Quenching efficiency of assemblies in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions(The inset corresponds to the linear plots of the detection)

2.4 Hg(Ⅱ)的检出限

图5(a)为在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液体系中，加入不同浓度Hg(Ⅱ)的荧光光谱图。随着Hg(Ⅱ)浓度的增加，体系的荧光强度逐渐变小，其荧光猝灭率((I0-I)/I0)与Hg(Ⅱ)浓度呈良好线性关系(图5(b))。这是因为Hg(Ⅱ)能够与核酸适配体中碱基胸腺嘧啶T特异性结合，形成稳定的“T-Hg(Ⅱ)-T”发夹状结构，会将Hg(Ⅱ)从组装体中解离出来，从而使组装体解组装，荧光探针尼罗红会被释放出来，从而使体系的荧光强度降低。方法的线性检测范围为1.0×10-11～1.0×10-10mol·L-1，计算可以得到Hg(Ⅱ)检出限为5.1×10-12mol·L-1。

2.5 Hg(Ⅱ)的选择性分析

图6 DTAB/Hg2+核酸适配体/尼罗红溶液中不同离子的荧光猝灭效率图Fig.6 Quenching efficiency of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions with different ions

为了验证组装体系对Hg(Ⅱ)的选择性，选取了K+、Na+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Pb2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+作为对照离子。图6中为加入不同离子时，对DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红溶液在638 nm处荧光强度的猝灭效率，其中每种离子的浓度均为1.0×10-4mol·L-1。在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红组装体系中加入Hg(Ⅱ)时，荧光猝灭率可达60%。而加入其他离子时荧光强度仅下降或上升约2%～12%左右，与加入Hg(Ⅱ) 相比，其他离子对于检测体系的影响可忽略不计。说明该DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红检测体系对Hg(Ⅱ)具有良好的选择性。

2.6 Hg(Ⅱ)在实际水样中的检测

为验证所构建体系实际检测能力，采用加标回收实验[3,7,9]。用自来水作为实际水样，配制DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红的检测溶液。滴加Hg(Ⅱ)标准溶液，浓度分别为5.0×10-11mol·L-1和1.0×10-10mol·L-1，在最优实验条件下，测定各溶液的荧光强度，根据线性方程计算出Hg(Ⅱ)的含量，计算得回收率为92%～107%，且相对标准偏差(RSD)在5%以内。

表1 实际水样中Hg(Ⅱ)的检测(n=3)

3 结论

利用带正电的表面活性剂DTAB与带负电的Hg(Ⅱ)核酸适配体通过静电与疏水作用组装，包埋荧光探针尼罗红，构建DTAB/Hg(Ⅱ)核酸适配体/尼罗红的“荧光关”检测Hg(Ⅱ)的检测体系。向该检测体系添加Hg(Ⅱ)的浓度为1.0×10-4mol·L-1时，荧光猝灭率达60%。检出限为5.1×10-12mol·L-1，线性检测范围为1.0×10-11～1.0×10-10mol·L-1。检测体系对Hg(Ⅱ)具有良好的选择性，且该方法可用于自来水中Hg(Ⅱ)的检测，回收率为92%～107%。