铝胁迫下栝楼根系分泌物对根生长及细胞壁官能团的影响

马 丽， 沈蔡慰， 陈 瑞， 吴玉环， 崔乐怡，陶 涛， 张婷婷， 朱叶心怡, 刘 鹏

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.杭州师范大学 生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

0 引 言

栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)是中国广泛种植的多年生攀援草本植物，从果实中提取的葫芦素D可用于开发抗肿瘤药物，块根可用于糖尿病的治疗[1].铝毒是制约全球酸性土壤地区农业生产的关键因素，全世界约50%的潜在耕地因土壤酸化引起的铝浸出而不能有效地发展为农业耕地[2].植物的根长及根系活力在铝胁迫下受到抑制，可以作为衡量植株是否遭受毒害的特征[3].根是植物生长发育过程中吸收营养和水分的器官，通常会分泌一些物质来帮助植株在逆境中更好地生存，这些物质被统称为根系分泌物，适量根系分泌物能够去除或中和土壤中的有毒物质，但分泌过多会产生自毒效应，从而造成双重胁迫[4].

细胞壁是植物细胞最外层的保护结构，细胞壁成分会随着外界环境条件的变化发生调整，成为抵抗外界不利环境的屏障.Baldwin等[5]探究低温胁迫下豌豆(PisumsativumL.)细胞壁代谢过程时发现，果胶含量及其甲酯化程度在胁迫下增加，从而减轻低温对植株的伤害.Fernandes等[6]采用红外光谱技术分析葡萄(VitisviniferaL.)愈伤组织细胞壁化学成分在矿质营养胁迫下的变化，发现长时间的胁迫会使植物细胞壁官能团的吸收峰发生明显的位移.因此，细胞壁成分及官能团变化对逆境下的植物来说是一个重要指标.目前有关铝胁迫与根系分泌物关系的探究主要侧重于铝毒对根系分泌物成分的改变[7]，而有关根系分泌物对铝胁迫下栝楼根际生长特性及细胞壁官能团的影响仍未见报道.研究以2种耐铝性有差异的栝楼为材料，通过解析根长、生物量、根系活力及细胞壁红外吸收光谱的变化，总结不同浓度根系分泌物对铝胁迫下根生长特性和细胞壁官能团的影响，推动铝毒机理研究，同时寻找能够有效缓解铝胁迫的途径，为栝楼在红壤地区的大面积种植和推广奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验室收集大量来自不同地区的栝楼种子，经ISSR遗传多样性分析和铝处理后筛选，得到亲缘关系较远且耐铝性差异较大的河北安国栝楼和浙江浦江栝楼作为实验材料[8]，其中河北安国栝楼耐铝性较强，而浙江浦江栝楼对铝敏感.

1.2 根系分泌物的收集

栝楼种子在砂床中萌发，选取长势良好且株高为15 cm的2种栝楼幼苗各40株，洗净根部后分别置于盛有8 L蒸馏水的塑料桶中培养24 h，收集培养液经真空旋转蒸发仪浓缩至500 mL，得到2种栝楼的根系分泌物置于-20 ℃冰箱中冷藏备用(根系分泌物成分可参考文献[9]).

1.3 材料处理

另取同期萌发且株高为15 cm的2种栝楼幼苗各54株，转移至装有5 kg试样土壤(红壤，来自浙江师范大学生物园，风干并磨碎过100目筛后使用)的塑料盆中，每盆3株，于恒温25 ℃，湿度75%，光照16 h，黑暗8 h的培养箱中进行培养.3 d后用AlCl3及根系分泌物对幼苗进行处理，其中铝处理设300，800 μmol/L 2个浓度，每盆添加AlCl3溶液50 mL，根系分泌物与铝处理同时进行，在铝处理的基础上设置4个处理组，分别添加根系分泌物0，20，30，60 mL，除上述8组外另设空白对照组CK，2种栝楼的9个处理组分别编号CK,Y300-0,Y300-20,Y300-30,Y300-60,Y800-0,Y800-20,Y800-30,Y800-60，每组6个重复，在处理7，14，21 d后，测定栝楼根部的各个生理指标.

1.4 生物量及根系活力的测定

将根剪下并洗净，用吸水纸吸干根表面水分并用分析天平测得根鲜重数据，随后将根放入称量瓶中，105 ℃烘干至恒重后称量得到根干重[10].根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11]：将根洗净后，称取0.3 g根尖置于试管中，加入0.4%TTC和H3PO4缓冲液(pH 7.5)各5 mL，37 ℃反应3 h，加入2 mol/L硫酸2 mL终止反应；将根取出并吸干水分，同3 mL乙酸乙酯及少量石英砂一起置于研钵中研磨，溶解后倒入10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容后静置至完全沉淀，取滤液于485 nm处比色，记录吸光度，查标准曲线得转铁蛋白(TRF)含量.

1.5 细胞壁官能团分析

剪取30个栝楼根尖，用0.5 mmol/L CaCl2清洗后蒸馏水洗涤2次，加入0.5 mL蒸馏水低温下进行研磨，研磨后10 000 r/min离心10 min，沉淀用1 mL 80%乙醇洗2次，用V甲醇/V氯仿=1/1混合溶液清洗一次，最后用1 mL丙酮清洗一次，沉淀进行冷冻干燥后得到细胞壁[12].取1 mg细胞壁，采用NEXUS 670傅立叶红外光谱仪(美国Nicolet公司)对细胞壁官能团进行分析.

1.6 数据处理

实验数据录入Excel 2010进行整理，数据通过SPSS 18.0软件进行统计学分析.用Origin 9.0软件绘制红外光谱图，并用Omnic 9.0软件进行数据分析.

2 结果分析

2.1 铝胁迫下根系分泌物对栝楼根系活力及根生物量的影响

通过对比安国栝楼3个周期中CK组与Y300-0,Y800-0的根长差异(见表1)，可以看到铝处理抑制根的伸长且高浓度铝的作用效果更加显著，7 d时Y300-0组最长根长为CK组的69.7%，Y800-0组则为CK的64.7%，14 d时Y300-0,Y800-0组的根长分别为CK组的64.4%和46.6%，21 d时为57.0%和42.6%，因此铝处理浓度与根伸长的抑制程度正相关.在添加根系分泌物后下安国栝楼的根长增加，在30 mL时根长达到最大值，但用量达到60 mL时根长降至CK组以下，7 d时Y300-20组的最长根长为Y300-0的1.7倍，CK组的1.2倍，Y300-30组的最长根长则达到了Y300-0的2.2倍，CK组的1.5倍，Y300-60组的根长则降至Y300-0的83.8%，CK组的58.5%，该结果表明，高浓度的根系分泌物并未对根长起促进作用，反而进一步抑制了根的伸长.

从表1中可以发现，根鲜重与干重的比值始终维持在10倍左右，且安国栝楼根鲜重、干重变化趋势与根长趋势一致，7 d时Y300-0组的根鲜重降至CK组的32.0%，Y300-20组的根鲜重为Y300-0的 3.3倍，CK组的1.1倍，Y300-30组的根鲜重为Y300-0的4.0倍，CK组的1.3倍，但Y300-60组的根鲜重却降至Y300-0的1.8倍，CK组的57.2%，鲜重仍在30 mL根系分泌物施用时达到最大，在60 mL处降至CK以下.另外，安国栝楼根系活力的改变也符合这一趋势，根中所测的各个指标存在相关性，通过分析各指标的变化趋势，表明铝胁迫下低浓度根系分泌物促进栝楼根部生长，高浓度根系分泌物抑制生长.

浦江栝楼4个指标的变化趋势与安国栝楼一致，但通过数据分析可确定二者的耐铝性存在差异.浦江栝楼与安国栝楼CK组的长势在14 d时最为接近，此时安国栝楼Y300-0组的鲜重为CK的31.8%，浦江栝楼Y300-0组的鲜重为CK的33.1%，表明300 μmol/L铝处理对2种栝楼的胁迫效果较为接近，但当铝处理浓度达到800 μmol/L时，安国栝楼Y800-0的鲜重为CK的36.8%，在浦江栝楼中却达到了19.0%.因此，高浓度铝胁迫对浦江栝楼的生长抑制作用强于安国栝楼.

2.2 铝胁迫下根系分泌物对栝楼根系细胞壁官能团的影响

2.2.1 不同处理下栝楼细胞壁红外光谱图

图1和图2中4 000 cm-1～1 330 cm-1是官能团区，1 330 cm-1～500 cm-1是指纹区.官能团区中3 285 cm-1左右较宽的吸收峰是-OH伸缩振动峰，2 920 cm-1处是C-H伸缩振动峰，1 640 cm-1附近的吸收峰是蛋白质的C=O伸缩振动峰(酰胺I带)，1 438 cm-1处的吸收峰是苯环骨架的伸缩振动峰，1 340 cm-1处的吸收峰是油脂化合物-CH2的弯曲振动峰.指纹区中1 240 cm-1附近是由蛋白质C-N伸缩振动和N-H的弯曲振动叠加形成的酰胺Ⅲ带，1 025 cm-1处的谱带为多糖骨架R-O键的振动吸收峰，690 cm-1处出现的吸收峰是N-H面外弯曲振动峰.上述吸收峰的存在表明细胞壁中含有氨基酸、多糖、蛋白质、脂肪、饱和烃和芳香类物质，图1和图2中浦江栝楼与安国栝楼的吸收峰种类相同，峰形相似，说明2种栝楼的细胞壁成分和含量相近.各峰中吸光度最高的是多糖骨架R-O振动吸收峰，该峰的峰强代表细胞壁中骨架多糖含量.因此，糖类是栝楼细胞壁最主要的组成物质.

表1 铝胁迫下根系分泌物对栝楼根系活力及根部生物量的影响

注：表内数字后字母表示不同处理差异(P<0.05).

铝处理后，R-O振动吸收峰和-OH伸缩振动峰的吸光度变化最为显著，其他吸收峰的强度并未发生明显改变，2类吸收峰的强度在铝处理后增强，但在根系分泌物添加后受到抑制.安国栝楼b,c,d,e组与a组的峰形基本一致，但f组的R-O振动吸收峰和-OH伸缩振动峰相比a组吸光度有明显的升高，g,h,i组与f组相比峰强有所降低，其中h组峰形与a组最为接近.浦江栝楼对铝处理更加敏感，2种栝楼a组的峰形相似，但浦江栝楼f,g,i组的R-O振动吸收峰和-OH伸缩振动峰的峰强明显高于安国栝楼.以上结果表明，铝处理使细胞壁多糖含量升高，并增加细胞壁上羟基的数量，根系分泌物能够抑制铝对细胞壁成分的改变，当根系分泌物用量达到30 mL时效果最好.另外，浦江栝楼在铝胁迫下红外光谱的变化大于安国栝楼，表明浦江栝楼对铝胁迫更加敏感.

2.2.2 不同处理下栝楼细胞壁官能团及红外吸收频率

a:CK;b:Y300-0;c:Y300-20;d:Y300-30;e:Y300-60;f:Y800-0;g:Y800-20;h:Y800-30;i:Y800-60

a:CK;b:Y300-0;c:Y300-20;d:Y300-30;e:Y300-60;f:Y800-0;g:Y800-20;h:Y800-30;i:Y800-60

通过分析表2、表3中数据可知，2 920 cm-1处C-H伸缩振动及1 640 cm-1处酰胺I带的红外吸收频率不变，而其他官能团在处理后吸收频率发生明显变化，因此，这2类官能团与胁迫无关.300 μmol/L铝处理下，安国栝楼-OH伸缩振动的吸收频率基本不变，但当铝处理浓度达到800 μmol/L时，官能团红外吸收频率由CK组的3 284 cm-1偏移至Y800-0组的3 328 cm-1处.数据表明,300 μmol/L铝胁迫处理对该官能团的影响并不显著，但800 μmol/L铝胁迫削弱了蛋白质和碳水化合物之间的氢键.Y800-20,Y800-30和Y800-60组的红外吸收频率分别为3 279 cm-1，3 269 cm-1和3 299 cm-1，该结果表明，根系分泌物能够缓解铝胁迫对官能团的损伤.表2中苯环骨架、-CH2对称弯曲振动峰、酰胺Ⅲ带和R-O振动吸收峰有相同的变化趋势，即红外吸收仅出现在CK和Y300-302组当中，这些官能团的变化说明，铝处理破坏了安国栝楼细胞壁上芳香化合物、油脂、蛋白质及多糖物质的结构，而30 mL根系分泌物最有效地缓解了300 μmol/L铝处理对官能团的损伤，但当铝处理浓度达到800 μmol/L时，官能团受到的损伤不可逆.

2种栝楼除N-H面外弯曲的其他官能团对铝胁迫及根系分泌物的响应方式基本相同，但-OH伸缩振动的吸收频率变化体现了2种栝楼的耐铝性差异.在300 μmol/L铝处理后，浦江栝楼-OH伸缩振动峰的吸收频率由CK组的3 286 cm-1偏移至3 320 cm-1处，而在安国栝楼中该吸收峰则由3 284 cm-1上移至3 288 cm-1，浦江栝楼-OH的偏移幅度更大.另外，浦江栝楼CK组-OH的红外吸收频率Y800-0,Y800-30组-OH伸缩振动峰的吸收频率分别为3 335 cm-1和3 333 cm-1，此时根系分泌物无法缓解-OH吸收频率的改变，因此,浦江栝楼对铝毒更加敏感.

表2 安国栝楼细胞壁官能团及其对应的红外吸收频率 cm-1

序号官能团CKY300-0Y300-20Y300-30Y300-60Y800-0Y800-20Y800-30Y800-601-OH3 2843 2883 2893 2893 2773 3283 2793 2693 2992C-H2 9222 9212 9242 9242 9232 9222 9222 9232 9223C=O1 6371 6371 6371 6371 6371 6371 6331 6341 6404C==C1 473,1 438,1 4011 4381 4381 473,1 438,1 4021 4301 4211 4381 426-5-CH21 341--1 339-----6C-N,N-H1 239--1 236-----7R-O1 057,1 0271 0251 0251 056,1 0261 0291 0261 0261 0241 0268N-H690--668-----

表3 浦江栝楼细胞壁官能团及其对应的红外吸收频率 cm-1

序号官能团CKY300-0Y300-20Y300-30Y300-60Y800-0Y800-20Y800-30Y800-601-OH3 2863 3203 3053 2873 2953 3353 3233 3333 3322C-H2 9212 9212 9252 9242 9232 9182 9222 9212 9203C=O1 6361 6411 6371 6351 6401 6371 6381 6371 6374C==C1 471,1 436,1 4011 4361 4381 471,1 436,1 4021 4331 4371 4251 4281 4325-CH21 378--1 375-----6C-N,N-H1 236--1 236-----7R-O1 054,1 0251 0311 0271 054,1 0271 0301 0281 0281 0271 0288N-H526-535-532-529528529

3 讨 论

根长及根系活力是植物在铝毒环境中最敏感的2个指标，而生物量的变化则是铝毒害根部的进一步表现[13].通过对上述生长指标的分析可知，栝楼生长在铝处理下受到抑制，但在根系分泌物添加后有不同程度的恢复，原因是铝毒通过阻碍根尖细胞的分裂抑制了根的伸长，而根系分泌物中的有机酸可与铝离子螯合形成稳定结构，从而缓解铝离子对植株造成的损伤[14].研究结果还体现了高浓度根系分泌物浓度对栝楼生长的抑制作用，Kopittke等[15]在研究根系分泌物对大豆(Glycinemax)铝胁迫的缓解机制时，同样发现了根系分泌物低浓度促进生长，高浓度抑制生长的现象.此类现象的出现可归因于根系分泌物中化感物质导致的自毒效应，根系分泌物除有机酸外还存在少量酚酸类物质，如苯酚、苯甲醛、肉桂酸等，此类物质浓度过高时会对植株造成毒害[16]，即农业生产中出现的“连作障碍”，因此,如何避免根系分泌物诱导的自毒效应是后续需要解决的关键问题.

植物细胞壁中富含果胶、纤维素和半纤维素等多糖，其中半纤维素和果胶是Al3+的结合部位[17].Zhu等[18]在水稻中的研究显示，铝毒促进水稻(Oryzasativa)细胞壁半纤维素和果胶的合成，研究中2种栝楼的R-O振动吸收峰在铝处理下升高，证实了铝毒对细胞壁多糖合成的诱导作用.该结果表明，铝胁迫可通过改变细胞壁成分从而增加Al3+在细胞壁上的结合位点，从而加强对植株造成的胁迫效果.另外，红外光谱中-OH伸缩振动峰的峰强在铝胁迫下提高，细胞壁上羟基的数目增多，Yang等[19]在研究铝胁迫对水稻的作用时则发现，铝胁迫增强果胶甲酯酶的活性，使得半乳糖醛酸的甲酯键水解为羧基，羟基和羧基上的氧原子均可与Al3+结合，上述结果表明，铝毒除改变细胞壁成分以外，还可通过修饰细胞壁物质官能团以增强细胞壁阳离子交换能力，方便Al3+与细胞壁的结合，从而加重植株的铝毒表型.根系分泌物添加后，R-O振动吸收峰和-OH伸缩振动峰的峰强减弱，说明根系分泌物通过抑制铝离子活性缓解铝毒.

铝处理下2种栝楼多个官能团的红外吸收频率发生变化，张晓斌等[20]发现凤眼莲(Eichhorinacrassipes)根细胞壁上羟基的氧配体可与镉离子结合，结合时-OH吸收峰向低频位移，而本实验中铝处理使-OH伸缩振动峰向高频位移.羟基红外吸收频率的偏移是由于-OH与Al3+的配位结合，当羟基上的O配体与金属离子结合时吸收频率发生变化，而红外吸收频率偏移方向相反是由于2类金属离子本身的性质差异.另外，铝处理使苯环骨架、-CH2对称弯曲、酰胺Ⅲ带及多糖骨架R-O键的吸收峰发生变化，说明铝处理可与细胞壁上芳香化合物、蛋白质、油脂和多糖上的这些基团发生交换或络合，因此，后续研究可从上述几类物质入手探究铝胁迫和细胞壁物质的相互作用.