地黄配方颗粒HPLC特征图谱研究及其毛蕊花糖苷含量测定

钟建荣 方小聪 冯旭俊 杨善岩 陈稳竹 刘丽云

摘要[目的]建立地黄配方颗粒的HPLC特征图谱，并测定其毛蕊花糖苷的含量。[方法]以流动相乙腈-0.1%冰醋酸水溶液，梯度洗脱，柱温25 ℃;体积流量1.0 mL/min;检测波长334 nm;进样量10 μL。[结果]建立了地黄配方颗粒的HPLC特征图谱，确定8个特征峰;毛蕊花糖苷在4.89～195.68 μg/mL（R2=0.999 6）与色谱峰面积呈良好的线性关系;其平均加样回收率为101.57%，RSD为1.29%。[结论]该方法简单、准确、重复性好，为地黄配方颗粒的工艺研究及质量控制提供了参考依据。

关键词地黄配方颗粒;毛蕊花糖苷;含量测定;HPLC特征图谱;质量控制

中图分类号R 286文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0187-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.051

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on HPLC Specific Chromatogram of Rehmannia Formula Granule and Determination of Acteoside Content

ZHONG Jian-rong1， FANG Xiao-cong2， FENG Xu-jun1 et al

（1. Hangzhou Minsheng Healthcare Co.， Ltd.， Hangzhou， Zhejiang 311100;2. Eye Health （Hangzhou） Pharmaceutical Co.， Ltd.， Hangzhou，Zhejiang 310018）

Abstract[Objective]The research aimed to establish the HPLC specific chromatogram of rehmannia formula granule and to determine acteoside content. [Method]For characteristic chromatograms，chromatographic experiments were performed with the mobile phase of 0.1% acetic acid-acetonitril in gradient elutione and the column temperature was set at 25 ℃. The detection wave length was 334 nm and the flow rate was 1.0 mL/min.[Result]The HPLC specific chromatogram of rehmannia formula granule showed 8 characteristic peaks，and the linear range of acteoside was 4.89-195.68 μg/mL（R2=0.999 6）， with average recovery at 101.57% （RSD=1.29%）. [Conclusion]This method is simple， accurate and good reproducibility， and can provide a reference for the technical study and quality control of rehmannia formula granule.

Key wordsRehmannia formula granule;Acteoside;Content determination;HPLC specific chromatogram;Quality control

地黃为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinasa Lbosch.）的新鲜或干燥块根，收载于《中国药典》（2015年版）一部，具有清热凉血、养阴生津等作用[1]。地黄为常用中药材，道地产区为河南省的武陟、温县和孟县等，后引种到山西省南部的临纷、侯马等地[2]。该研究是在中医药理论的指导下，依据《中药配方颗粒管理暂行规定》和《中药饮片质量标准通则（试行）》的要求，根据现代药理研究发现地黄中主要有效成分具有一定的水溶性[3-5]，故采取水煎对地黄中有效成分进行提取后，按一定的工艺制成地黄配方颗粒[6-7]。地黄中主要含有环烯醚萜类、紫罗兰酮类、苯乙醇苷类、糖类等化合物[8-11]，由于环烯醚萜类化合物存在不稳定性[12-13]，为此该研究建立以毛蕊花糖苷为代表化合物的苯乙醇类化合物的特征图谱，，并测定其毛蕊花糖苷的含量，为地黄配方颗粒质量标准的制定提供理论依据，以保证配方颗粒工艺的稳 定性。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。干燥地黄样品于2015—2016年分别在河南、山西、陕西采集，经鉴定为玄参科植物地黄（Rehmannia glutinasa Lbosch.）的干燥块茎，按《中国药典》中的炮制规范将药材炮制成饮片。

1.1.2

主要仪器。高效液相色谱仪Agilent 1200，紫外检测器。色谱柱：Welch Xtimate C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;Diamonsil C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.1.3主要试剂。毛蕊花糖苷对照品，批号111530—201310，中国食品药品检定研究院;甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯;超纯水自制。

1.2方法

1.2.1

色谱条件。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25 cm，内径为4.6 mm，粒径为5 μm，Welch Xtimate C 18柱）;以乙腈为流动相A，以0.1%乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱程序：0～32 min，15%～18% A;32～50 min，19% A;柱温为25 ℃;流速为1.0 mL/min;检测波长334 nm。

1.2.2

配方颗粒的制备。参照《中药配方颗粒管理暂行规定》，制备15批地黄配方颗粒，即取一定量的地黄饮片，浸泡30 min，煎煮2次，每次1.5 h，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.20（55 ℃），减压干燥，粉碎，加糊精适量，制粒，即得地黄配方颗粒。其中，小试地黄饮片用量为1 kg/批，制成量 0.264 kg（得率26.40%）;中试地黄饮片用量为20 kg/批，制成量5.336 kg（得率26.63%）;大生产地黄饮片用量为 200 kg/批，制成量53.428 kg（得率26.71%）。

1.2.3供试品和参照物溶液的制备。

1.2.3.1

对照品溶液的制备。精密称取，毛蕊花糖苷 10.86 mg，用流动相溶解并定容至100 mL容量瓶中，混匀，即得母液，从母液中移取1 mL溶液于10 mL容量瓶中，流动相定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

1.2.3.2

供试品溶液的制备。取本品，研细，取约10.0 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，置具塞试管中，精密加入甲醇 250 mL，称定重量，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取滤液50 mL浓缩至近干，残渣用流动相溶解，转移至50 mL容量瓶中，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 mL，减压回收溶剂至近干，残渣用流动相溶解，并转移至5 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

1.2.3.3

空白对照溶液的制备。依照配方颗粒有关标准，由相关辅料制得地黄配方颗粒的空白对照品，按照“ 1.2.3.2”方法制得空白对照溶液。

1.2.4毛蕊花糖苷含量测定的方法学考察。

1.2.4.1

线性关系考察。精密称取毛蕊花糖苷对照品 24.45 mg，用流动相定容于50 mL容量瓶中，摇匀，得到浓度为 0.489 mg/mL的对照品母液。分别精密吸取0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mL母液，置50 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，各精密进样10 μL，测定峰面积，以毛蕊花糖苷峰面积（Y）为纵坐标、对照品浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，建立线性回归方程。

1.2.4.2精密度试验。精密吸取毛蕊花糖苷对照品溶液 10 μL，连续进样5次，按“1.2.1”色谱条件测定峰面积，并计算RSD。

1.2.4.3稳定性试验。按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、24、36 h注入液相色谱仪，记录毛蕊花糖苷峰面积，计算峰面积的RSD。

1.2.4.4重复性试验。按照“1.2.3.2”方法制备6份供试品溶液，进样分析，计算峰面积的RSD。

1.2.4.5

回收率试验。取已知含量的同一批样品6份，每份取约1.0 g，精密称定，按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，精密加入毛蕊花糖苷对照品溶液，进样测定，计算回收率 及RSD。

1.2.4.6样品的测定。取不同批次的地黄配方颗粒样品，按照 “1.2.3.2”方法制備供试品溶液，按照“1.2.1”的色谱条件进行测定，记录峰面积。

1.2.5地黄配方颗粒特征图谱的方法学考察。

1.2.5.1精密度试验。按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样5次，按照“ 1.2.1”的色谱条件进行测定，记录相对峰面积，并计算RSD。

1.2.5.2稳定性试验。按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8、12、24、36 h进样，按照“1.2.1”的色谱条件进行测定，记录相对峰面积，并计算RSD。

1.2.5.3

重复性试验。试验精密称取同一样品6份，按照 “1.2.3.2”方法制备供试品溶液，按照“1.2.1”的色谱条件进行测定，记录相对峰面积，并计算RSD。

1.2.5.4

HPLC地黄配方颗粒特征峰及相对保留时间的确定。将15批地黄配方颗粒样品分别按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，进而按照“1.2.1”的色谱条件进样检测，确定毛蕊花糖苷特征峰，并选定峰面积相对较大、重复性好的作为参照峰（S），依据《中国药典》2015年版关于中药特征图谱的规定，计算各特征峰与S峰的相对保留时间。

1.2.5.5

不同批次地黄配方颗粒HPLC特征图谱的比较。分别按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，进而按照“1.2.1”的色谱条件进样检测，比较不同批次地黄配方颗粒HPLC特征图谱中峰数目及相对峰面积，并计算其RSD。

2结果与分析

2.1毛蕊花糖苷含量测定的方法学考察

2.1.1线性关系考察。按照“1.2.4.1”方法操作，测得峰面积分别为1.938 7、2.025 3、2.718 5、5.357 0、4.451 5、 5.318 0，以毛蕊花糖苷峰面积（Y）为纵坐标、对照品浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=17.72X+ 1.852（R2= 0.999 6），表明毛蕊花糖苷在4.89～ 195.68 μg/mL呈现良好的线性关系。

2.1.2精密度试验。按照“1.2.4.2”方法操作，测得峰面积分别为3.127 8、 3.127 7、3.127 9、3.127 7、3.127 8，计算得峰面积的RSD为0.002 8%，表明精密度良好。

2.1.3稳定性试验。按照“1.2.4.3”方法操作，测得毛蕊花糖苷峰面积分别为3.127 7、3.127 8、3.127 9、3.127 2、 3.127 3、 3.127 5，峰面积的RSD为0.009 %，表明供试品溶液在 36 h内 稳定。

2.1.4重复性试验。按照“1.2.4.4”方法操作，测得毛蕊花糖苷的峰面积分别为3.127 3、3.127 1、3.127 7、3.127 2、 3.128 0、3.127 2，其RSD为0.011 3%，表明该方法重复性 良好。

2.1.5回收率试验。从表1可以看出，回收率平均值为 101.57%，RSD为1.29%，可见回收率、RSD均符合要求，说明该方法准确度良好。

2.1.6样品的测定。从表2可以看出，相同批次地黄饮片制备的配方颗粒的毛蕊花糖苷含量测定结果相近，表明配方颗粒的制备工艺相对稳定。

2.2地黄配方颗粒特征图谱的方法学考察

2.2.1精密度试验。按照“1.2.5.1”方法操作，测得色谱峰面积分别为3.127 1、3.126 9、3.127 2、3.127 3、3.127 6，相对峰面积的RSD为0.008 3%，说明仪器精密度 良好。

2.2.2稳定性试验。按照“1.2.5.2”方法操作，测得色谱峰面积分别为3.127 4、3.126 8、3.127 4、3.127 6、3.127 0、3.127 3、 3.126 8、3.127 9，相对峰面积的RSD为0.012 4%，符合特征图谱要求，表明供试品溶液在36 h内较稳定。

2.2.3重复性试验。按照“1.2.5.3”方法操作，测得色谱峰面积分别为3.127 7、3.127 8、3.127 4、3.127 6、3.127 0、 3.127 9，相对峰面积的RSD为0.010 4%，表明该方法重复性良好。

2.2.4HPLC地黄配方颗粒特征峰及相对保留时间的确定。由图1可知，15批地黄配方颗HPLC特征图谱有8个特征峰，其中5号峰为毛蕊花糖苷，峰面积相对较大，重复性好，作为参照峰（S）。从表3可以看出，各共有峰的相对保留时间的平均值分别为0.362（峰1）、0.587（峰2）、0.727（峰3）、 0.840（峰4）、1.077（峰6）、1.251（峰7）、3.658（峰8）。

2.2.5

不同批次地黄配方颗粒HPLC特征图谱的比较。从表3、4和图1可以看出，不同批次地黄配方颗粒HPLC特征图谱的特征峰数目及相对峰面积有一定差异，其共有峰平均相对峰面积分别为0.427（峰1）、0.273（峰2）、0.148（峰3）、 0.165（峰4）、0.135（峰6）、0.294（峰7）、0.632（峰8），各峰RSD值分别为23.31%、18.81%、20.76%、31.92%、24.40%、 29.56%、23.67%。

3结论与讨论

此次研究在含量测定的色谱条件的基础上进行特征图谱的色谱条件优化，同时比较不同厂家不同型号色谱柱下各峰的分离情况，发现Welch Xtimate C 18色谱柱各峰的分离效果良好，优于其他色谱柱，故需要规定色谱柱。另考察不同柱温下（20、25、30、35 ℃）色谱峰分离情况，发现25 ℃时各峰的分离效果良好，故确定柱温为25 ℃。对15批地黄配方颗粒的特征图谱进行比较分析，发现来源于不同产地颗粒的色谱峰整体形貌特征具有一定的相似性，个别色谱峰存在差

异，同时综合分析各批次地黄配方颗粒的HPLC特征图谱，共确定8个共有峰，其中将5号峰（毛蕊花糖苷色谱峰）作为参照峰。比较各峰相对保留时间和相对峰面积发现，其相对保留时间较为稳定，而不同批次颗粒的相对峰面積的RSD较大，具有一定的批间差异，推测其原因可能由于药材本身具有一定的差异。取地黄饮片粉末按照“1.2.3.2”方法制备供试品溶液，以“1.2.1”色谱条件进样检测，得到特征图谱，与相应颗粒的特征图谱进行比较，发现饮片与颗粒之间具有一定的物质传递关系，二者整体形貌特征基本一致。该试验建立了地黄配方颗粒的含量测定方法，并建立了地黄配方颗粒特征图谱，确定15批配方颗粒的8个共有特征峰，可从全面控制配方颗粒的质量，为其工艺研究及质量标准的建立提供了参考依据。

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