麦洼牦牛PRL基因多态与产奶性状的关联分析

李铸 何世明 吴锦波 艾鷖 蹇尚林 刘建 雍军

摘要研究旨在了解麦洼牦牛催乳素（PRL）基因的单核苷酸多态性（SNP），探究与牦牛产奶性能相关的分子标记。通过对PCR产物进行直接测序筛选麦洼牦牛PRL基因的SNP位点，运用DNAMAN和SPSS等软件对PRL基因型与产奶性状进行了统计分析。结果表明，位于PRL基因996 bp处发现一个疑似SNP位点，该位点T碱基缺失突变;对比麦洼牦牛不同PRL基因型的产奶性状，突变型个体的 153 d产奶量、乳蛋白质率、乳糖率和乳中的体细胞数均下降（ P>0.05），而乳脂率则显著升高（P<0.05），暗示该处碱基T碱基缺失对乳中脂肪含量有显著影响。

关键词牦牛;PRL基因;SNPs;产奶性状;关联分析

中图分类号S 823.8+5文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0108-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.028

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Correlation Analysis on Polymprphism of Prolactin Gene with Milk Performance Traits in Maiwa Yak

LI Zhu，HE Shi-ming，WU Jin-bo et al（Institute of Animal Science and Technology of Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture， Hongyuan，Sichuan 624402）

AbstractIn order to study the single nucleotide polymorphism （SNP） of the Maiwa yak prolactin gene and to explore the molecular markers related to milk performance traits of yak. We used the direct PCR sequencing method to screen the SNPs， and analyzed the correlation between prolactin genotype and milk performance traits by employing statistical softwares such as DNAMAN and SPSS.The results showed that we found one SNP site which located at 996 bp of prolactin gene and its T-base deletion mutation at this site. By comparing the milk performance traits of different prolactin gene types， the 153 d milk yield， lactoprotein， milk sugar and somatic cell number in milk of mutant individuals were lower than normal genotype individuals （P>0.05）， while the milk fat increased significantly （P<0.05）. It was suggested that the absence of T-base had a significant effect on the fat content of Maiwa yak milk.

Key wordsMaiwa yak;Prolactin gene;Single nucleotide polymorphism;Milk performance traits;Correlation analysis

麦洼牦牛属于草地型牦牛，主产于位于川、甘、青3省结合部的四川省红原县麦洼、瓦切乡和若尔盖县包座乡等地区，中心产区在红原县麦洼地区，在周边的黑水县、阿坝县、壤塘县、九寨沟县和松潘县等地区也有分布[1]。麦洼牦牛是青藏高原的地方优良品种， 具备乳、肉兼用的种质特性， 已被列入《中国牛品种志》和《四川家畜家禽品种志》[2]。我国现有饲养量约170万头，占全国牦牛总数的11%，具有适应性好、产乳性好、乳脂率高和驮力大等优点，不仅是我国著名奶肉兼用型地方优良品种，还是牦牛遗传资源宝库中珍贵的种质资源和基因库[3]。

催乳素（prolactin， PRL）是由199个氨基酸残基组成的一种蛋白质，由腺垂体分泌，其主要功能是促进乳腺发育，引起和维持泌乳。牦牛PRL基因全长为9 647 bp，可转录出X1、X2和X3三型催乳素，其中X1型和X2型催乳素基因均由5个外显子组成，而X3型催乳素基因由4个外显子组成。PRL通过与靶细胞膜表面的催乳素受体结合，启动JAK2/STAT5信号转导途径，最终激活反式作用因子STAT5，使其作用于乳蛋白基因启动子区的靶序列，启动或增强以乳蛋白基因启动子为作用元件的靶基因的表达[4]。此外，PRL基因还在个体生殖生理调控、应激反应、免疫活动及渗透压调节、神经系统信号传递等方面具有一定的作用，被认为是对奶牛泌乳性能具有重要作用的候选基因。

近年来研究发现，催乳素基因对哺乳动物的乳腺发育和泌乳具有影响作用，尤其是与产奶量和乳成分呈正相关，因此成为学者们的研究热点。例如，在PRL基因全序列克隆方面，有学者采用Long PCR等方法克隆得到全长 9 388 bp的牛催乳素基因组序列[5]，而后利用亚克隆的方法构建该基因组的pcDNA3.1（+）/ bPRL重组表达载体并转染COS-7细胞，结果通过RT-PCR成功扩增到了预期目的片段，证实了该基因组DNA在转录水平上的生物学功能[6];有学者以PRL基因外显子为研究对象，分別对第2[7]、第3[8]和第4[9]这3个外显子的群体遗传特征进行了相应分析。而对于牛PRL基因与泌乳性状之间的相关性，学者们也进行了大量的研究，有学者综述了PRL的结构与功能、基因定位及作用机制、PRL上的SNPs与产奶性状关系等几个方面的内容[10];有学者采用PCR-RFLP技术检测分析了荷斯坦奶牛催乳素基因的多态性，结果检测到AA、AB、BB这3种基因型[11];国外学者如Mehmannavaz等[12]、Alfonso等[13]研究也证实PRL基因与产奶性状之间具有很大相关性。

目前已有对麦洼牦牛基因SNPs的部分研究，但对PRL基因单核苷酸多态性的研究还鲜见报道。近年来，阿坝州畜牧科学技术研究所与西南民族大学、四川省草原科学研究院、阿坝州畜牧工作站等单位合作，在红原县开展麦洼牦牛高产奶新品系选育工作。笔者以PCR法和测序法研究牦牛催乳素基因单核苷酸多态性，探讨与牦牛产奶性状之间的相关性，旨在为麦洼牦牛高产奶品系选育工作提供参考和为进一步确定催乳素基因功能奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

于阿坝州红原县玛莎村、热多村和泽木科3个区域随机抽取活泼健康、体形正常的2～4胎次母牦牛49头，并记录其耳号。于2017年6—10 月清晨牧民挤奶时测定日挤奶量，每10 d测定一次，指标测定和记录均分别由专人进行。挤奶量测定期间同时采用无菌注射器采集麦洼牦牛血样，共取得血样49份，盛装于无菌15 mL离心管中。血样现场暂存于冰盒中，后保存于-60 ℃超低温冰箱中待用。

1.2主要试剂

血液基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit，50preps离心柱型）产自天根生化科技（北京）有限公司;PCR反应体系配制使用的2×Taq PCR Mastermix购自天根生化科技（北京）有限公司;Trizma base， Brotic acid和EDTA等试剂均产自VETEC公司;核酸染料Goldview 购自博奥拓达科技（北京）有限公司。

1.3DNA提取和检测

采用血液基因组DNA提取试剂盒提取麦洼牦牛血样DNA。血样于-60 ℃冰箱中取出后放置于水中解冻，再按照DNA提取试剂盒中提供的说明书步骤进行操作，提取DNA产物放置于-20 ℃冰箱中备用。制备1%琼脂糖凝胶，用移液枪吸取1 μL的6×Loading buffer，与 4 μL DNA产物在PE手套上混匀，再吸取混匀后的液体加入琼脂糖凝胶板上的点样孔内，旁边点上Marker DNA 4 μL， 121 V条件下电泳40 min，再通过照胶仪于紫外光下检测DNA纯度，对有杂带或纯度不高的样品重新提取血液DNA并进行检测。

1.4引物合成和PCR扩增

参考文献[9]中对水牛PRL基因多态性的研究，设计一对引物序列用于样品中PRL基因的扩增，引物序列为F：5-AAGCCTTTTACATTATTTCAACCC-3，R：5-AATTCTCTGACCTCA AGCCACTCT-3，引物由上海英潍捷基公司合成。PCR扩增产物长度为1 103 bp。

PCR反应体系25 μL：包括DNA模板1 μL，上下游Primer各1 μL，2×Taq PCR Mastermix（含染料）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃终延伸5 min;4 ℃保存。制备1%琼脂糖凝胶，PCR反应结束后取5 μL产物电泳40 min后，于紫外灯下观察其扩增结果。合格PCR产物保存于-20 ℃冰箱中，以待测序。

1.5SNP筛选和序列分析

按照测序要求准备PCR产物及引物，直接寄送英潍捷基贸易有限公司（广州实验室）进行双向测序。测序返回的正反向序列，运用DNAMAN 5.0对扩增序列的测序结果与NCBI上参考目的片段序列进行比对并校正拼接;使用Chromas软件对测序峰图进行分析，筛选获得SNPs位点。

1.6统计分析

运用DNAMAN5.0对序列进行校正和比对分析，测序峰图采用Chromas软件进行分析，利用SPSS 21.0软件比较样本类群间2种基因型和产奶量之间的关联性，并进行显著性检验（P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性 差异）。

2结果与分析

2.1麦洼牦牛基因组DNA提取与检测

采用紫外分光光度计对提取的麦洼牦牛血液基因组DNA进行纯度检测，浓度均在100 ng/μL以上，DNA样品测定的OD 260/OD 280比值均在1.6～1.8，符合要求。经1%的琼脂糖凝胶电泳检测（图1），在紫外灯照射下基因组DNA条带明亮单一，表明所提DNA样品浓度质量好，可以用于展开后续的PCR试验。

2.2牦牛PRL基因PCR扩增产物检测

根据设计引物对麦洼牦牛PRL基因的5侧翼调控区序列进行扩增，扩增出的麦洼牦牛PRL基因序列长度为1 103 bp，产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯照射下结果均和目的片段大小相一致，条带单一且清晰（图2），可用于测序分析。

2.3牦牛PRL基因SNPs的筛查和检测

扩增产物经胶回收纯化后进行正反双向测序，均由测序公司完成。采用DNAMAN 5.0软件拼接原始序列，并对测序峰图进行分析，共筛查到1个疑似SNP位点，位于目标基因序列的998 bp处，正常序列为5-ATGAAATG-3，突变序列为5-A_GAAATG-3，该处碱基T缺失。进一步比对全部样本的测序结果，共计29个样本中发现了该位点处T碱基缺失，初步确定为SNP位点。

2.4PRL基因多态性与牦牛泌乳性状的相关性

将所有样本按照突变型（T碱基缺失）和正常型分为2组，对2种基因型下牦牛153 d产奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖和体细胞数等進行相关分析。表1显示了PRL基因不同基因型对麦洼牦牛产奶性状的影响。从表1可以看出，经检验分析，2种基因型下牦牛产奶性状存在一些差异，部分指标差异显著（P< 0.05）。具体而言，T碱基缺失后，麦洼牦牛153 d产奶量、乳蛋白质率、乳糖率和乳中的体细胞数均呈降低趋势，但经显著性检验后差异并不显著（P>0.05），特别的，乳脂率在PRL基因998 bp处T碱基缺失后显著升高了（P<0.05），暗示该处T碱基缺失对乳中脂肪含量有显著影响。

3討论

PRL基因与乳脂等泌乳性状极度相关，也是奶牛产奶性状的主要候选基因，但目前对牦牛催乳素基因SNPs的研究还较少。该研究于阿坝州红原县搜集了49个麦洼牦牛的血液样本，并提取DNA和设计引物，再通过直接测序法筛选PRL基因的疑似突变位点，以期找出与麦洼牦牛泌乳性状相关的SNPs。对测序结果分析后发现有29个样本于PRL基因996 bp处T碱基突变缺失，且该位点突变对牦牛产奶性状有显著影响，但目前该种基因型的个体数量较少，因此在后续的研究中有必要进一步扩大样本群体来加以验证。经统计分析，这种T碱基突变型对乳脂的含量有显著影响，因此有可能作为影响麦洼牦牛产奶性状的一个重要候选基因型进行分子遗传标记，进而应用到麦洼牦牛高产奶群的选育工作中。

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