猪细小病毒NJ株ST细胞适应性研究

唐波 刘国阳 常晨 华涛 张道华

摘要为评价ST细胞代次的增高对猪细小病毒NJ株免疫原性的影响，将第10、30、60代ST细胞分别接种猪细小病毒NJ株F8 、F18代毒种进行病毒培养，通过检测其病毒含量、血凝价以及制备疫苗免疫机体的抗体水平等指标来进行评价。结果表明，各代次病毒含量为107.2～107.5TCID 50/mL，血凝价为29～210;制苗后免疫阴性豚鼠与后备母猪，免疫28 d后均出现抗体反应，HI效价分别为27～29和28～29。不同代次毒种接种不同代次ST细胞培养的病毒含量、血凝价及疫苗免疫效力均符合要求。各代次细胞增殖性能稳定，培养的PPV NJ株均能满足兽用生物制品的生产要求。

关键词猪细小病毒;ST细胞;适应性

中图分类号S 852.65+1文献标识码A

文章编号0517-6611（2019）18-0093-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.023

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Study on the Adaptation of Porcine Parvovirus to ST Cell Line

TANG Bo1，2，3，4，LIU Guo-yang1，2，3，4，CHANG Chen1，2，3，4 et al（1.Institute of Veterinary Immunology Engineering，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;2.National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biologicals，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;3.Jiangsu Key Laboratory for Food Quality and Safety-State Key Laboratory Cultivation Base，Ministry of Science and Technology，Nanjing，Jiangsu 210014;4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou，Jiangsu 225009）

AbstractIn order to evaluate the effects of generation change of swine testicle cell on the immunogenicity of NJ strain of porcine parvovirus，the 10th，30th and 60th generations of ST cells were inoculated with F8 and F18 virus of NJ strain of porcine parvovirus and cultured.And the virus content，hemagglutination titer and antibody level of vaccine immune were detected.The results showed the virus content of different generations was 107.2-107.5 TCID 50/mL，the haemagglutinin titer was 29-210.The negative guinea pigs and prepubertal sows were immunized with the prepared vaccine，antibody response appeared after immunization 28 days，and HI titer were 27-29 and 28-29 respectively.The virus titer，hemagglutination titer and immune efficacy of inoculation with different generations of ST cell were in accordance with the requirements.All generations of cells had stable proliferation performance，PPV NJ strain cultured could meet the production requirements of veterinary biology product.

Key wordsPorcine parvovirus;ST cells;Adaptation

豬细小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原严重危害我国养猪业[1]。该病主要引发初产母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪，其他类型猪感染后则无明显的临床症状[2]。PPV的主要传染源是带毒猪，感染猪长期排毒使得其在猪群中很难清除[3]。近年来，随着规模化猪场的不断扩大，该病在我国的流行呈上升趋势[4]。目前血清学调查证实国内猪群中该病的阳性率超过90%，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[5]。目前国内控制猪细小病毒病流行的最有效方法仍是灭活疫苗的免疫[6]。猪细小病毒疫苗生产中常用ST细胞来增殖病毒，如何获得满足生产要求且具有良好免疫原性的ST细胞适应株显得尤为 重要[7]。

猪细小病毒NJ株为江苏省农业科学院动物免疫工程研究所分离及纯化获得的疫苗生产株，该毒株免疫原性良好具有疫苗候选株的潜力。笔者通过研究PPV NJ株不同代次毒种接种不同代次ST细胞，探讨病毒培养含量、血凝价及制备疫苗免疫效力随着细胞代次增加的变化，旨在为分析具有良好稳定细胞适应性的PPV NJ株是否能够满足工业化大生产要求提供科学依据。

1材料与方法

1.1毒株和细胞

ST细胞系购自美国菌种保藏中心（ATCC），9代、29代、59代由江苏省农业科学院传代保存;猪细小病毒毒种NJ株F8、F18代由江苏省农业科学院分离并保存。

1.2主要试剂试验所用DMEM培养液、新生牛血清均为Gibco公司产品。

1.3试验动物

350～400 g豚鼠（猪细小病毒HI抗体为阴性），来源于南京青龙山实验动物中心;5～6月龄阴性后备母猪（猪细小病毒HI抗体为阴性），购自江苏明天农牧科技公司。

1.4病毒毒价测定

将ST细胞铺于96孔培养板中， 0.1 mL/孔，将不同时间段病毒液进行10倍稀释，每个稀释度分别接种10孔，0.1 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察并记录细胞病变，采用Reed-Muench法计算TCID 50。

1.5血凝（HA）与血凝抑制（HI）抗体的检测

1.5.1血清样品的处理。将100 μL血清56 ℃水浴中灭活 30 min后，加入300 μL 25%白陶土悬液，混匀后室温下作用30 min;10 000 r/min离心10 min，吸取上清后加入100 μL 20%豚鼠红细胞，振荡、混匀后37 ℃下作用1 h;4 000 r/min离心10 min，收集上清即为待检血清样品。

1.5.2血凝试验（HA）和血凝抑制试验（HI）抗体测定。具体操作方法参考文献[8]。

1.6试验设计

1.6.1病毒培养。

将传代后ST细胞10代、30代、60代培养至生长致密度35%～45%后，分别加入含0.5%猪细小病毒F8、F18代毒种细胞维持液，37 ℃下培养，当细胞病变达到75%时反复冻融3次后收获。

1.6.2疫苗制备。

分别取各组培养物20 mL，用终浓度0.1%甲醛溶液灭活24 h，经灭活检验合格后按水油相比1∶3 乳化制备疫苗。

1.6.3豚鼠效力检验 。

用体质量350～400 g PPV HI抗体阴性（HI效价应不高于23）豚鼠5只，各肌肉注射疫苗0.5 mL。28 d后连同对照豚鼠3只采血测定抗体。对照豚鼠应为阴性，免疫豚鼠至少应有4只出现抗体阳性（HI效价应不低于26）。

1.6.4后备母猪效力检验。

每批疫苗用5～6月龄猪细小病毒HI抗体阴性的后备母猪5头，各肌肉注射疫苗2 mL（1头份）。28 d后，连同条件相同的3头对照猪采血并检测HI抗体 效价。

2结果与分析

2.1各代次ST细胞培养病毒的含量和血凝效价测定结 果

对各代次细胞培养病毒进行检验，发现均无细菌生长。病毒含量为107.2～107.5TCID 50/mL，血凝效价（HA）为29～210;各代次细胞培养不同代次的PPV NJ株病毒含量均维持在稳定水平（表1）。

2.2疫苗免疫豚鼠HI抗体检测

每批疫苗免疫28 d后分别采血检测HI抗体，结果见图1。从图1可以看出，6批疫苗豚鼠血清HI抗体全部阳性效价为 27～29。各免疫组间抗体水平无显著差异，空白对照则全部为阴性。

2.3疫苗免疫5～6月龄后备母猪HI抗体检测结果

每批疫苗分别免疫5～6月龄后备母猪，28 d后采血检测HI抗體效价。从图2可以看出，免疫猪抗体全部阳性HI效价为 28～29，对照猪则均为阴性。该试验结果表明，第10、30、60代细胞培养的猪细小病毒NJ株均具有较好的免疫原性，制备的各批次疫苗在后备母猪上均具有较高的抗体水平。

3讨论

国内控制猪细小病毒病流行的最有效方法是疫苗免疫，疫苗质量在疾病防控环节中尤为关键。猪细小病毒在ST细胞上的稳定高效培养是研制其疫苗产品的基础。该研究中的PPV NJ株具有疫苗候选株的潜力，其病毒培养滴度高、免疫原性好[9]。然而，在大生产过程中ST细胞代次的增高是否会影响PPV NJ株的免疫原性还有待进一步研究。石慧颖等[10]报道，乙脑病毒P3株在vero细胞上传代后免疫原性会发生明显下降。徐涤平等[11]研究表明筛选一株具有良好稳定细胞适应性的疫苗候选株对疫苗质量至关重要，确保病毒在不同代次细胞上的稳定增殖水平是生产优质高效疫苗的首要 因素。

该研究将ST细胞10代、30代、60代分别接种猪细小病毒F8、F18代毒种进行病毒培养，随着细胞代次的增加，病毒含量、血凝价和免疫效力检测结果均未见明显下降。结果表明，不同代次毒种接种不同代次ST细胞培养增殖性能稳定，均能符合生产要求，这为后续相关疫苗的研制奠定了重要 基础。

参考文献

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