酰胺醇类-噁唑烷酮类交叉耐药基因在某规模化养猪场的流行情况分析

杨梦艳,于润浩,王囡囡,李德喜,杜向党

(河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450046)

肠球菌为革兰氏阳性(G+)球菌,它作为条件致病菌,广泛分布于自然环境及人和动物消化道内。自20世纪80年代以来,肠球菌严重感染所致疾病的发生率和病死率明显升高,并且肠球菌的固有耐药和获得性耐药使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。因此,对肠球菌耐药性方面的研究显得尤为重要。

氟苯尼考(Florfenicol, FFC)是动物专用酰胺醇类抗生素,被广泛用于兽医临床防治猪、牛等动物的细菌感染性疾病。利奈唑胺已被广泛应用于临床中,作为治疗革兰氏阳性细菌感染的最后一种抗菌剂,该抗菌剂已被批准上市。最近的研究数据显示肠球菌分离株对利奈唑胺耐药率低(<1.00%)[1,2]；酰胺醇-噁唑烷酮类新耐药基因optrA是可水平转移的噁唑烷酮类耐药基因,它在多重耐药革兰氏阳性菌中的出现和流行,严重威胁公共卫生安全。

optrA耐药基因在2015年首次于粪肠球菌中被发现[3]；噁唑烷酮类耐药基因optrA是继多重耐药基因cfr之后第二个可介导噁唑烷酮类药物耐药的可转移耐药基因[4,5],其介导的肠球菌对利奈唑胺的耐药情况在2006～2016年集中暴发[6]。对optrA基因的研究证实,optrA基因位于质粒上[7],可以发生水平传播。optrA基因被定义为ATP结合盒(ABC)转运蛋白[8],赋予了对噁唑烷酮和酰胺醇类的可转移抗性。optrA可介导酰胺醇类-噁唑烷酮类交叉耐药,对氯霉素、氟苯尼考、四环素、利奈唑胺等产生耐药[9-11]。

2018年意大利分离出1株optrA与cfr双阳性菌株，这两个基因共同介导对噁唑烷酮类药物耐药[12]。2019年希腊报道在人源中首次检出optrA基因[13]。optrA是近年来新发现的酰胺醇类-噁唑烷酮类耐药基因[14,15]。酰胺醇类药物的作用机理主要是抑制细菌肽酰转移酶的活性,阻止肽链延伸以达到抑制细菌生长的目的[11]。噁唑烷酮类耐药基因主要通过ABC转运蛋白的方式对药物产生耐药[16]。利奈唑胺和泰地唑利属于噁唑烷酮类化学合成药物,分别在2000年、2014年被美国FDA批准进入临床应用[10,14,17,18]。在肠球菌中,对利奈唑胺的耐药性通常由23S rRNA基因(G2576T或G2505A)的V结构域中的突变介导[19]。

河南省是全国重要的养殖大省,该省对养殖场水源的检测侧重于重金属含量等,而极少关注水源中肠球菌等微生物的污染情况。大肠杆菌和肠球菌是重要的环境指示菌,同时又是潜在的动物条件性致病菌,而有关河南省养殖用水微生物污染情况的调查未见相关报道。

本实验采集河南省某规模化猪场52株不同来源的肠球菌,通过细菌分离鉴定、PCR检测、16S rRNA菌属鉴定、MLST分型、接合转移试验及药物敏感性试验,检测了该养猪场肠球菌的耐药情况,结果显示水源的optrA阳性肠球菌可发生水平转移[7],很有可能形成养殖场耐药基因多组合链式传播。

1 试验材料

1.1 菌株的来源

52株肠球菌来自河南某规模化养猪场于2018年采样的分离菌株,其中水源2株,母猪源19株,仔猪源18株,苍蝇源10株,病猪2株,其它内脏源3株。肠球菌受体菌JH2-2为本实验室保存。

1.2 主要试剂、药物

BHI肉汤培养基、肠球菌显色培养基、MHB肉汤培养基购自河南信诚致远生物科技有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根有限公司;药物氟苯尼考、利福平购自济南奥瑞特兽药原料有限公司;利奈唑胺购自美仑药业有限公司；红霉素、氯霉素、四环素、环丙沙星、庆大霉素购自中国兽药药品监察所。

2 试验方法

2.1 菌株的鉴定与保存

将采样的52份样品接种划线于肠球菌显色培养基,置37 ℃恒温培养箱培养24 h,然后挑取在显色培养基上变黑的单克隆于BHI肉汤培养基中,在37 ℃气浴摇床上以200 r/min过夜培养。在细菌培养完成后,用50%的甘油与菌液按1∶1的比例各吸取500 μL，保存于-20 ℃冰箱。余下的菌液用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。

2.2 optrA、poxtA、cfr耐药基因的检测

根据NCBI Genbank中已发布的酰胺醇类-噁唑烷酮类耐药基因optrA、16S rRNA以及MLST分型序列,利用Oligo 7设计特异性引物,对52株野生株进行optrA、poxtA、cfr、16S rRNA、int5801基因的检测,对4株接合子进行optrA、int5801的检测。各引物的反应条件如表1所示, MLST分型的引物见表2。

表1 PCR扩增及测序所用引物

表2 MLST分型所用引物

2.3 药物敏感性测定

将optrA阳性的接合子、供体菌及受体菌划线接种到BHI琼脂培养基上,挑取单克隆于无药肉汤培养基培养8 h左右,测量麦氏比浊度为0.5左右时,可进行药物敏感性实验。药敏实验采用微量肉汤倍比稀释法,药物选用氟苯尼考、利奈唑胺、环丙沙星、利福平、四环素、氯霉素、庆大霉素、链霉素共8种药物,判定按照美国临床微生物药敏实验判定标准[8]执行。药敏板为96孔板,实验过程中设置ATCC 25922为质控菌,根据CLSI判定标准进行耐药基因判定。

2.4 平板接合试验

选择粪肠球菌JH2-2作为受体菌,接合实验的具体步骤参照文献[20],用128 μg/mL利福平及10 μg/mL氟苯尼考双抗BHI琼脂培养基筛选接合子,在37 ℃下孵育16～24 h后,在选择性平板上生长,通过抗菌药物敏感性实验和MLST确证。

3 结果与分析

3.1 样品菌株耐药基因的检测与分析

检测结果见图1～图6以及表3。PCR检测结果显示：某规模化养猪场粪肠球菌optrA阳性菌株共39株,optrA阳性检出率为75%(39/52);母猪源粪肠球菌13株,optrA阳性率为68.4%(13/19);仔猪源粪肠球菌12株,optrA阳性率为66.7%(12/18);病猪源粪肠球菌2株,optrA阳性率为100%(2/2);苍蝇源粪肠球菌10株,optrA阳性率为100%(10/10);水源粪肠球菌2株,optrA阳性率为100%(2/2);poxtA阳性菌株仅检测到1株,来自母猪源粪肠球菌,阳性检出率为0.19%(1/52);cfr阳性菌株0株,阳性检出率为0%。

M: DL2000 marker; 1:阴性对照; 2:样品菌株。

M: DL2000 marker; 1:样品菌株; 2:阴性对照。

3.2 接合试验结果

将optrA耐药基因阳性分离菌株作为供体菌株,将4株供体菌分别命名为EF8z、EF8w、EF8f和EF8p。通过氟苯尼考药物筛选后获得4株接合子，将它们分别命名为EF8w-JH22(水源粪肠球菌接合子,接合效率为5.9×10-5)、EF8z-JH22(仔猪源粪肠球菌接合子,接合效率为1.5×10-4)、EF8f-JH22(苍蝇源接合子,接合效率为3.9×10-4)、EF8p-JH22(病猪源粪肠球菌接合子,接合效率为3.3×10-4)。

M: DL2000 marker; 1:阴性对照; 2:样品菌株。

M: DL2000 marker; 1:阳性对照; 2:样品菌株。

3.2.1 接合子optrA耐药基因的验证 结果如图7所示。

3.2.2 野生株、接合子、受体菌药物敏感性实验结果 结果如表4所示。

3.2.3 接合子供体菌株多位点序列分型结果 分型结果见表5。

4 讨论

4.1 酰胺醇类-噁唑烷酮类交叉耐药基因的检测

Wang等[16]检测了1998～2014年某医院保存的肠球菌，发现有2.0%的菌株携带optrA基因；对2009～2013年食用性动物来源的菌株进行检测，optrA的阳性率为15.5%[22]。Cui等[22]对2010～2014年分离的1159株肠球菌进行研究,发现有2.9%的菌株携带optrA基因。Zhuo等[5]自2014年4月至2017年11月测试了27株肠球菌对利奈唑胺的敏感性,从中获得了23株optrA阳性菌株,阳性检出率为85.1%。赵等从2015年采集的513份样品中选择86份样品，采用含氟苯尼考(10 μg/mL)的选择性培养基分离菌株,共获得了17株optrA阳性菌株,阳性检出率为19.7%[4]。Zhang等[23]在2011～2016年从医院分离了1623个肠球菌菌株,包括789株粪肠球菌和834株屎肠球菌,发现33.93%的粪肠球菌和0.24%的屎肠球菌对利奈唑胺具有抗性,18.18%携带cfr,27.27%携带optrA,54.55%携带cfr和optrA。本试验于2018年在河南某规模化养猪场采样52份样品，从中分离到39株optrA阳性粪肠球菌,optrA阳性检出率高达75%,poxtA基因阳性检出率为0.19%。poxtA为2017年新发现的新的酰胺醇类-噁唑烷酮-四环素抗性基因交叉耐药基因[21],虽然该猪场poxtA阳性检测率呈较低水平,但仍然存在潜在威胁。综上所述,近10年多药耐药基因optrA在肠球菌中的检出率呈上升趋势。

M: DL2000 marker; 1:阴性对照; 2:样品菌株。

M: Marker; 1: aroE; 2: psts; 3: gki; 4: gyd；

表3 某规模化养猪场粪肠球菌耐药基因的阳性检测率

表4 野生株、接合子、受体菌的药敏实验结果

注: CHL，氯霉素; FFC，氟苯尼考; LZD，利奈唑胺; TET，四环素; ERY，红霉素; VAL，沃尼妙林; GEN，庆大霉素; CIP，环丙沙星; STR，链霉素; RIF，利福平; JH2-2:粪肠球菌受体菌。

表5 接合子供体菌株MLST分型结果

M: Marker; 1:供体菌株; 2:接合子; 3:受体菌株; 4:阴性对照。

4.2 接合转移实验及多位点序列分型情况

接合实验结果表明,optrA基因发生了水平转移,并且optrA基因可能位于一个可转移的接合质粒上,并通过质粒的转移使受体菌株获得耐药性。通过对结合成功的供体菌株进行多位点序列分型,其中水源粪肠球菌、病猪源粪肠球菌、苍蝇源粪肠球菌均为ST692型,仔猪源粪肠球菌的MLST分型为ST632,这表明了optrA耐药基因阳性环境分离株的遗传相关性,并且推测optrA耐药基因可通过水源-猪源-苍蝇源介导的多组合链式进行传播,从而给临床用药添加极大难度。养殖场环境极其复杂,对养殖场水源肠球菌检测的关注度较低,当养殖场中动物饮用污染水源后,由水源传播的流行质粒感染危害就更加严重。

4.3 展望

通过本实验研究,发现optrA基因发生了接合转移,但今后对其基因遗传环境仍需进一步研究；我们拟将通过S1 nuclease-PFGE和Southern blotting对optrA质粒进行分析以及定位,对阳性菌株进行细菌全基因组测序,对耐药基因的具体传播方式进行确证。