功能性发酵剂对发酵香肠氧化稳定性及挥发性风味物质的影响

曹辰辰，冯美琴，孙 健,*，徐幸莲，周光宏

（1.南京农业大学食品科技学院，国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095；2.金陵科技学院动物科学与技术学院，江苏 南京 210038）

发酵香肠因其良好的口感和独特的风味而受到消费者的喜爱，其中脂肪和蛋白质是发酵香肠中重要的组成部分，直接影响香肠的感官特性。在发酵过程中，脂肪的适度氧化会产生小分子挥发性化合物，对于醛类、烃类、醇类、酸类及酮类等挥发性风味成分的产生有重要作用，可改善肉制品的风味[1-2]。而脂肪的过度氧化会导致香肠风味变差、失去较好的质构特性和色泽，降低保藏期限，带来安全隐患，从而影响消费者的接受程度。发酵香肠在加工过程中受到许多因素的影响而加剧脂肪氧化，如脂肪含量、肉的搅碎程度及搅碎时间、pH值、氯化钠相对含量等[3]。蛋白质降解也是发酵肉制品加工过程中重要的化学变化，蛋白质适度的降解可以产生一些小肽和氨基酸等物质，提升产品的风味和营养价值，但蛋白质的过度氧化会对发酵肉制品的风味、色泽、质地、保水性、消化性等产生不利影响[4]。因此在发酵香肠的加工过程中，采用适当的方法抑制脂肪和蛋白质过度氧化具有重要意义。

目前，不少企业为延长发酵肉制品货架期在其中加入人工抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯和特丁基对苯二酚等。人工合成抗氧化剂虽然在一定程度上能抑制氧化，却存在食品安全风险[5]。据报道，人工合成抗氧化剂存在不安全因素，甚至可能具有毒性[6]。据Halliwell等[7]报道，二丁基羟基甲苯能够抑制人呼吸酶的活性，摄入过多会引发癌症和畸形等病症。随着发酵食品消费量的增加，越来越多的研究集中在开发新的益生菌，以增强产品感官特性和健康益处。乳酸菌在发酵肉制品中发挥重要的作用[8]。在发酵肉制品中，乳酸菌有助于形成低分子质量化合物，如肽[9]。肽不仅有助于发酵产品中特有风味的形成，还具有不同的生物活性，如抗氧化、抗高血压和降胆固醇[10]。而葡萄球菌具有良好的蛋白酶和脂肪酶活性，对产品风味的形成起很大的促进作用。据Gallego[11]和Xing Lujuan[12]等报道，微生物有利于发酵肉制品产生肽，从中提取的肽具有良好的抗氧化活性，可以作为食品系统中合成抗氧化剂的替代物，具有安全高效的特点，从而避免了使用合成抗氧化剂的风险。帅瑾[13]报道了接种混合发酵剂能够有效抑制香肠在发酵成熟中的过度氧化。此外，乳酸菌自身的抗氧化性已经得到许多学者的证实，Li Shengyu等[14]报道从中国传统香肠中分离出的植物乳杆菌C88具有良好的羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除活性；Das等[15]报道了植物乳杆菌DM5具有较强的羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基清除活性；Han等[16]报道了从哈尔滨干香肠中分离的弯曲乳杆菌R5和发酵乳杆菌R6具有良好的抑制脂肪过氧化的能力；所以乳酸菌可以作为一种食源性抗氧化剂进行应用。因此，本实验将筛选出的具有良好加工特性和益生特性的乳酸菌和符合发酵剂标准且经过较为全面的安全风险评估（包含血浆凝固酶、溶血、耐热核酸酶、生物膜、药敏、毒力基因等测定及动物毒理实验验证）的葡萄球菌作为发酵剂，接种发酵香肠，以自然发酵和商业发酵剂为对照，探究功能性发酵剂对发酵香肠抗氧化效果及挥发性风味物质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CD101，NCBI编号为MG798695）、模仿葡萄球菌（Staphylococcus simulans NJ201，NCBI编号为MG798671）由本实验分离鉴定所得。

1.1.2 香肠原辅料

猪瘦肉、猪背膘、猪肠衣 江苏省苏食肉品有限公司南京分公司；葡萄糖 南通奥凯生物技术开发有限公司；亚硝酸钠 杭州龙山化工有限公司；异抗坏血酸钠 郑州拓洋实业有限公司；盐、蔗糖、姜粉、五香粉、白胡椒粉 市售。

1.1.3 试剂

蛋白质羰基试剂盒 北京索莱宝生物有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 南京杰汶达生物科技有限公司；三氯乙酸、氯仿、碘化钾、乙二胺四乙酸二钠、异丙醇、石油醚、氢氧化钾、2-硫代巴比妥酸等 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TC 12E绞肉机 意大利Sirman公司；VF608灌肠机德国Handtmann公司；KBF 240恒温恒湿箱 德国Binder公司；FE20 pH计 美国Mettler Toledo公司；HVE-50自动高压灭菌锅 日本Hirayama公司；SPX-250B-Z生化培养箱 上海博讯实业有限公司；Ultra Turrax T25高速匀浆机 德国IKA公司；Spectral Max M2e多功能酶标仪美国伯腾仪器有限公司；SIM-F-124制冰机 日本Sanyo公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂的活化与制备

将L. plantarum CD101和S. simulans NJ201分别在液体MRS和MSA培养基中37 ℃孵育24 h，活化3 次后，4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤3 次后重悬，菌悬液保留备用。

1.3.2 发酵香肠的制作

基本配方：新鲜猪瘦肉与猪背膘（质量比8∶2），其他成分以肉质量为基础，添加量为食盐2%、蔗糖1%、葡萄糖1%、亚硝酸钠0.015%、异抗坏血酸钠0.05%、姜粉0.1%、白胡椒粉0.1%、五香粉0.1%，发酵剂浓度为107CFU/g。

在研究三中，通过问卷调研我们发现，沟通越是靠近同步的程度，消费者就越能获得更强的心流体验。与此同时，研究三还对研究模型进行了整体检验。由于每个人对同步和异步的感知不同，所谓沟通的同步性也并不是保证信息的交流必须精准定位到同一个时间点。通过此研究，我们得出的结果是，沟通越是接近于同步性，也就是其他用户回复速度越快，用户的体验感越强。沟通是一个循环往复的交互过程，而交互则意味着反馈的重要性。即时的反馈能带来更强的融入感，也就可能进行更多的分享和交换，使得消费者在各个心理机制中表现出显著的高水平。

工艺流程：原料肉的选择→漂洗→绞肉→低温腌制→搅拌→灌肠→恒温发酵→干燥成熟。

在30 ℃、相对湿度80%的条件下发酵24 h后，移入15 ℃、相对湿度75%以减缓发酵，最后12 ℃、相对湿度72%干燥成熟得到成品。根据不同的实验组添加发酵剂，分为3 组：1）对照组，不添加任何发酵剂，自然发酵，简称CK组；2）商业发酵剂组，添加发酵剂Lyocarni VBM-60进行发酵，简称CM组；3）实验组：采用107CFU/g接种量按照1∶1接种L. plantarum CD101和S. simulans NJ201进行发酵，简称LC组。分别于香肠的加工及贮藏过程中的0、1（发酵结束）、5、9（成熟）、14、21（成品）、35 d（贮藏2 周）抽取样品进行测定。

1.3.3 过氧化值（peroxide value，POV）的测定

按照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》[17]的方法进行测定。

1.3.4 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值的测定

参照李鸣等[18]的方法并稍作修改，取4 g绞碎肉样，加20 mL 7.5%的三氯乙酸（含0.1% EDTA-Na2），冰浴匀浆15 s两次，调平后12 000×g离心5 min。取2 mL上清液，加入2 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液，90 ℃水浴40 min，取出流动水冷却后，1 000×g离心5 min，上清液中加2 mL氯仿摇匀，静置分层后取上清液在532 nm波长处测定吸光度。用四乙氧基丙烷作标准曲线，TBARS值以肉样中丙二醛含量计，单位mg/kg。

1.3.5 羰基值的测定

使用索莱宝蛋白质羰基试剂盒测定，方法参照说明书，用蛋白质中羰基含量（nmol/mg）表示。

1.3.6 巯基值的测定

参照Zakrys-Waliwander等[19]的方法稍作修改。取3 g剔除脂肪和筋膜的香肠样品，加入5 ml 0.2mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.4），于8 000 r/min冰浴匀浆2 次，每次15 s。取0.5 mL匀浆液于试管中，加入5 mL 50 mmol/L、pH 7.0的磷酸盐缓冲液，加入2.5 mL 10 mmol/L的DTNB（溶于0.1 mol/L，pH 8.0的Tris缓冲液）。反应液在25 ℃孵育30 min，于1 000×g离心5 min，测定上清液在412 nm波长处的吸光度。摩尔消光系数为13 600 L/（mol·cm），用于计算蛋白质中巯基含量，结果表示为nmol/mg。

1.3.7 挥发性风味物质的测定

采用固相微萃取法进行样品处理。取5 g样品置于20 mL顶空瓶中压盖，将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，同时启动仪器采集数据。

色谱条件：使用TR-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），以氦气为载气，流速1 mL/min。升温程序：炉温在40 ℃保持3 min，以5 ℃/min的升温速率升至90 ℃，不保持，再以10 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持6 min。

质谱条件：离子源温度200 ℃，电离方式为电子电离，电子能量70 eV，发射电流120 μA，扫描质量范围m/z 30～550。根据峰面积归一法计算每种风味化合物的相对百分含量。

1.4 数据处理

本实验每个处理设置5 个重复，数据采用SAS 9.1软件中的Duncan新复极差法进行显著性分析：P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著。采用Factorial ANOVA进行方差分析，使用Origin 7.0绘图软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对发酵香肠POV的影响

图1 不同处理对发酵香肠POV的影响Fig. 1 Effect of different starter cultures on POV of fermented sausages

POV是评价脂肪氧化的初期产物氢过氧化物含量的指标，氢过氧化物极不稳定，很快再氧化反应生成酸、醛和酮等[20]。香肠在加工和贮藏过程中，脂肪容易在脂肪内源酶的作用下发生大量降解，其中含有双键的不饱和脂肪酸由于其性质很不稳定，容易被氧化成氢过氧化物，使得香肠的POV急剧增加[21]。如图1所示，在香肠的成熟过程中，不同处理组的POV总体呈现上升趋势，表明3组香肠的脂肪氧化程度随着时间的延长而不断加深，这与李静等[20]的研究结果类似。据报道[22]，在脂肪自动氧化的初期，过氧化物的生成速率大于其分解速率，使得过氧化物积累，进而导致POV逐渐升高。通过分析发现POV随时间因素变化极显著（P＜0.01），不同处理对POV的影响极显著（P＜0.01），同时二者交互作用也极显著（P＜0.01）。在发酵初期，3 组香肠的POV都较低，到第5天时CK组的POV大幅增加，这可能是CK组中氢过氧化物的形成速率快于分解速率导致。从第5天开始，LC组的POV显著低于CK和CM组（P＜0.05），至第35天时CK、LC、CM组的POV分别达到41.83、17.40、27.54 mg/100 g。表明接种发酵剂在一定程度上抑制了香肠脂肪的氧化，且LC组的抗氧化效果优于CM组。

2.2 不同处理对发酵香肠TBARS值的影响

图2 不同处理对发酵香肠TBARS值的影响Fig. 2 Effect of different starter cultures on TBARS value of fermented sausages

TBARS值是评价脂肪氧化程度的重要指标，主要反映了脂肪二级氧化产物丙二醛的含量[23]。如图2所示，TBARS值随时间因素变化极显著（P＜0.01），不同处理对TBARS值影响极显著（P＜0.01），二者的交互作用极显著（P＜0.01）。结果表明，3 组香肠的TBARS值都呈上升趋势，这与姜蕾等[24]的研究结果一致。因为随着脂肪氧化程度的加深，次级产物逐渐增多，因此TBARS值也不断增大。从第9天开始，LC组的TBARS值显著低于CM和CK组（P＜0.05），且LC与CM组的TBARS值增加趋势减缓，至第35天时CK、LC、CM组的TBARS值分别达到3.58、1.35、1.58 mg/kg。表明接种发酵剂在一定程度上抑制了丙二醛的产生，且LC组的抗氧化效果优于CM组。

本研究结果表明添加功能性发酵剂对香肠的POV和TBARS值均有抑制作用，且LC组的抗氧化效果优于CM组，该结果与帅瑾[13]和黄露[25]的研究结果一致。此外，Ruiz-Moyano等[26]报道了使用乳酸片球菌SP979接种发酵伊比利亚香肠使得其TBARS值显著低于自然发酵组香肠。据Mejri等[27]报道，使用L. plantarum和L. pentosus等接种发酵香肠有助于产生抗氧化肽，呈现良好的抗氧化活性。此外，部分学者[14-15]还报道了乳酸菌对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基等具有良好的清除活性。因此，LC组的抗氧化效果可能与选取具有蛋白酶活性较强的发酵剂接种发酵有关，使得蛋白质在内源酶和微生物蛋白酶共同的作用下产生抗氧化肽，而抗氧化肽对自由基具有清除作用，从而阻断了链式反应，替代自由基与不饱和脂肪酸结合，最终抑制脂肪氧化。同时，可能还与乳酸菌自身的抗氧化作用有关，具有一定的自由基清除能力。

2.3 不同处理对发酵香肠羰基值的影响

蛋白质氧化会导致氨基酸侧链及肽键的断裂，从而形成羰基，同时可以与二硫键作用使蛋白质交联，从而导致蛋白质功能特性的下降[28]。不同处理组香肠的羰基值变化如图3所示，羰基值受时间和处理因素的影响均为极显著（P＜0.01），且时间与处理的交互作用极显著（P＜0.01），随着时间的延长，3 组香肠中羰基值都逐渐增大，表明蛋白质氧化程度不断加深，该结果与前人的研究结果一致[29]。结果表明，0～5 d时3 组香肠的羰基值差异均不显著（P＞0.05），且上升缓慢，从第9天开始羰基值显著上升，LC与CM组显著低于CK组（P＜0.05），但其二者之间差异不显著。至第35天时，LC组与CM组的羰基值差异不显著（P＞0.05），分别达到3.84 nmol/mg和4.27 nmol/mg，但显著低于CK组的5.88 nmol/mg（P＜0.05）。表明接种发酵剂在一定程度上抑制了羰基的产生，但LC与CM组的处理对蛋白氧化的抑制效果相当。

图3 不同处理对发酵香肠羰基值的影响Fig. 3 Effect of different starter cultures on protein carbonyl content of fermented sausages

2.4 不同处理对发酵香肠巯基值的影响

图4 不同处理对发酵香肠巯基值的影响Fig. 4 Effect of different starter cultures on protein sulfhydryl content of fermented sausages

蛋白质表面的半胱氨酸残基的氧化会导致巯基被氧化成二硫键、磺酸、次磺酸等，巯基值越低证明蛋白质氧化程度越大[24]，因此巯基值可以表示蛋白氧化的程度。如图4所示，巯基值受时间和处理因素的影响均极显著（P＜0.01），且时间与处理的交互作用极显著（P＜0.01）。随着时间的延长，不同处理组的香肠巯基值均呈现下降趋势。发酵第1天时3 组香肠的巯基值显著下降（P＜0.05），但0～5 d时3 组香肠之间的巯基值差异均不显著（P＞0.05），表明此阶段不同处理对巯基值无影响。在9～21 d阶段，LC组与CM组的总巯基值差异不显著（P＞0.05），但显著高于CK组（P＜0.05），表明LC与CM两组的处理对蛋白质巯基氧化的抑制效果相当，这与羰基测定的结果一致。而在第35天时，LC组的巯基值达到32.86 nmol/mg，显著高于CM组的29.32 nmol/mg和CK组的18.56 nmol/mg（P＜0.05），表明添加功能性发酵剂能有效抑制蛋白的氧化。此外祝超智[3]报道了在广式腊肠的加工过程中加入不同浓度的粗肽液对蛋白质氧化有良好的抑制效果。

2.5 不同处理对发酵香肠挥发性风味物质的影响

表1 不同处理组挥发性风味物质的比较Table 1 Comparison of volatile flavor compounds of fermented sausages with different starter cultures

表2 不同处理组风味物质相对含量Table 2 Relative contents of flavor compounds in fermented sausages with different starter cultures%

续表2 %

续表2 %

如表1和表2所示，不同处理组发酵香肠共测出134 种挥发性化合物，其中包括醛类18 种，醇类24 种，酸类10 种，酯类25 种，酮类10 种，碳氢化合物41 种，其他类6 种。LC组检测出的挥发性风味物质种类最多，共检测出105 种风味物质，而CK和CM组分别检测出91 种和93 种风味物质。3 组香肠中，醛类物质的比重最大，其中CK组达到28.88%，显著高于LC与CM组（P＜0.05），这表明香肠中主要的风味物质是醛类，而LC组检测出16 种醛类物质，种类数高于CK和CM组。由表2知，在醛类物质中，占比重最大的是己醛，这与先前研究结果一致[30]。其次多的为醇类，LC组达到21.63%，显著高于CK和CM组（P＜0.05）。此外，酸类、酯类和碳氢化合物等相对含量也都在10%以上，而酮类和其他类相对含量较少，其中LC组的酯类和酮类的相对含量显著高于其余两组（P＜0.05），但3 组香肠的挥发性风味物质总相对含量差异不显著（P＞0.05）。

醛类物质的阈值较低，主要来源于油酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的氧化以及氨基酸降解，是发酵香肠中最重要的风味化合物[31]，其中己醛是含量最高最主要的醛类，能够反应脂肪的氧化程度[30]。本实验结果表明CK组的醛类相对含量显著高于其余2组，表明该组香肠的脂肪氧化程度最大，而LC组的相对含量显著低于CM组，表明其抗氧化效果优于CM组发酵剂，这与前面的脂肪氧化实验结果一致。另外，LC组的庚醛、辛醛和苯甲醛等相对含量显著高于CM组，同时新检出了癸醛、戊醛等对照组中没有的风味物质，表明接种发酵剂能够明显改善香肠的风味，LC组的发酵剂效果优于CM组。据报道[32]，戊醛、庚醛、辛醛和癸醛分别具有脂香、奶香、鲜草香和甜香味，而苯甲醛具有苦杏仁味，微量的苯甲酸能够带给发酵肉制品特别的风味。

发酵香肠中的醇类物质主要通过微生物对糖类的代谢产生，如乙醇和2,3-丁二醇等；部分醇类通过脂肪氧化产生，如1-辛烯-3-醇；该物质具有蘑菇香气并且阈值较低，具有一定代表性，因此对发酵香肠的风味形成有一定的作用[33]。本研究表明，在醇类中相对含量最大的是乙醇，其次是2,3-丁二醇，且LC组显著高于其余2组，这与之前的研究一致[32]。可能是因为LC组的乳酸菌代谢碳水化合物的能力较强，导致LC组的醇类相对含量较高。此外，本研究中LC组的1-辛烯-3-醇的相对含量显著高于其余2组，这也表明接种该组发酵剂有助于改善香肠的整体风味。

在发酵肉制品中，酸类物质较为重要且富有代表性，同时对生成酯类物质有贡献作用[30]。可以发现3 个处理组中含量最高的均为乙酸，其中LC和CM组显著高于CK组，这是因为乙酸主要通过微生物代谢碳水化合物产生，而LC与CM组中有大量乳酸菌，发酵产酸能力较强；另外脂肪与氨基酸代谢也会产生乙酸[33]。而LC组的乙酸含量低于CM组，可能是因为乙酸和乙醇发生酯化，生成乙酸乙酯。另外，丁酸也是一种重要的风味物质，LC组的丁酸含量显著高于其余两组，表明接种该组发酵剂对香肠的风味形成有一定贡献。

据报道[34]，酯类物质是由醇和酸经过酯化反应生成的，多带有芳香味，其中短链酸形成的酯类多呈水果香，长链酸形成的酯多呈较淡的油脂味，因此酯类对发酵香肠典型的风味形成有一定作用。LC组的乙酸乙酯和乳酸乙酯的相对含量均显著高于CK与CM组，表明该组发酵剂对香肠风味的形成有一定贡献，这可能因为LC组的醇类和酸类的相对含量较高，因此发生酯化反应后生成的酯类相对含量大。而酮类、碳氢化合物等阈值较高，对香肠特征风味的形成影响不大，因此对香气的贡献可以忽略。但是值得注意的是，LC组的3-羟基-2-丁酮相对含量较高，而该物质具有黄油味和干酪味，对香肠的风味有重要贡献[30]。

3 结 论

本实验使用功能性发酵剂混合发酵香肠，以添加商业发酵剂和自然发酵作为对照，通过POV、TBARS值、羰基值、巯基值和挥发性风味物质含量等结果探究功能性发酵剂对发酵香肠抗氧化及挥发性风味物质的影响。结果表明，接种功能性发酵剂L. plantarum CD101和S. simulans NJ201制作发酵香肠在一定程度上能够抑制产品的脂肪氧化和蛋白氧化，其中抑制脂肪氧化的能力明显优于商业发酵剂，而在蛋白氧化的抑制方面与商业发酵剂效果相当。同时，接种功能性发酵剂能够显著增加香肠的挥发性风味物质种类，提升产品的营养价值，改善风味，并且其效果优于商业发酵剂组。