萨拉米香肠发酵成熟过程中蛋白质水解及脂质氧化规律

韦友兵，吴 香，周 辉，李新福，李 聪，徐宝才*

（1.江苏雨润肉食品有限公司，江苏 南京 211806；2.肉品加工与质量控制国家重点实验室，江苏 南京 211806；3.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230000；4.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230036）

萨拉米香肠是以猪、牛肉为原料，利用微生物或组织内源酶发酵生产的具有特殊风味、色泽和质地及较长保质期的肉制品[1-2]。萨拉米香肠在发酵成熟过程中，会发生一系列的生化反应，从而产生不同的风味物质。这类反应主要是蛋白质和脂肪的分解氧化，一部分靠原料肉内部的酶催化完成，另一部分则与其中的微生物密切相关[3]。另外，在蛋白质及脂质发生水解过程中，还会发生一系列的氧化还原反应，例如氨基酸脱氨脱羧、脂肪酸脱水氧化等，这些均能促进发酵肉制品的风味形成[4]。发酵肉制品中大多数的风味物质均产生于发酵成熟阶段，可以通过添加不同的酶制剂或腌制剂丰富产品的风味品质[5]。在萨拉米香肠的发酵成熟过程中，肌肉内的脂质在微生物[6-9]及脂质水解酶的作用下，可以产生大量的游离脂肪酸；另外，这些脂肪酸中的部分不饱和脂肪酸在微生物和脂肪氧合酶的作用下，被氧化为小分子芳香类物质，是构成产品风味的重要组成部分[10-13]。但是，过度的脂质氧化也是发酵肉制品酸败、褐变的重要原因，极大降低肉制品的品质。脂质氧化的主要原料为不饱和脂肪酸，其初级代谢产物对产品的风味无明显的贡献作用，而其二级氧化产物可以产生大量的烷烃、醇类、碳酸类小分子风味及滋味物质[14]。脂肪酸经过β-氧化后可以产生酮类物质，也会对产品风味起到积极作用。脂肪酸氧化产物也可以与脂肪酸一起发生缩合反应产生令人愉悦的酯类成分。典型的意大利发酵香肠中即含有大量的酯类风味成分，我国发酵肉制品中也含有大量的酯香类物质[15]。

本实验以萨拉米香肠为研究对象，针对其发酵过程中主要发酵菌种变化对产品蛋白质、脂肪等水解和氧化程度的影响，探寻萨拉米香肠发酵成熟过程中蛋白质水解规律和脂质氧化规律，可以为萨拉米香肠的生产加工提供技术指导，提供科学完整的质量品质评价体系，对于改善萨拉米香肠的质量品质以进一步满足消费者需求有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻猪肉、香辛料、食盐、葡萄糖、D-异抗坏血酸钠、硝酸钾、亚硝酸钠（均为食品级） 江苏雨润肉食品有限公司；SM-181型号菌种发酵剂（包括清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）（＞2.9×109CFU/g）） 科汉森（中国）有限公司；C6～C20烷烃标准品 美国AccuStandard Inc公司；二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸、柠檬酸三钠、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、氯仿、甲醇、异丙醇、冰乙酸、乙醚、硫酸铜、氢氧化钠、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考马斯亮蓝、巯基乙醇、过硫酸胺碳酸钠、盐酸、NaOH、甘氨酸、Na2HPO4、KH2PO4、氯化钾、甲醛溶液均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

UV-2600紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；Allegra-64R台式冷冻离心机 美国Beckman公司；NHWY-200B台式全温度恒温摇床 常州诺基仪器有限公司；2300型KjeltecTM自动凯氏定氮仪 丹麦Foss分析仪器公司；602S稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂；FR-980生物电泳图象分析系统 上海复日科技有限公司；Trace MS气相色谱-质谱联用仪 美国Finnigan公司；DB-5毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，1 μm）美国J&W Scientific公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；DC-12H型氮吹仪 上海安谱科学仪器有限公司；氨基酸自动分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 萨拉米香肠加工流程及取样

萨拉米香肠加工工艺：原料肉→解冻→预斩→绞制→撒料（发酵剂接种）→打散→搅拌→灌装→发酵成熟→剥皮包装。

其中：原料肉剔除筋膜等杂质后，采用低温解冻，解冻室温度在0～4 ℃，待中心温度达到-2.5～-1.5 ℃时解冻结束；将解冻好的原料肉投入斩拌锅斩拌，刀和锅采用低速斩拌待肉块变小易于绞肉后，即可将肉馅送入绞肉机中，斩拌后肉温不得超过0 ℃；将混合后的辅料（含菌种发酵剂）均匀撒在传送带上的肉馅表面，经过打散机打散，使肉馅和辅料混合均匀；待颜色均一，肉馅相互之间有黏连即可停止搅拌，出机待灌装；采用不可食胶原蛋白肠衣灌装，灌装后的肠体应饱满紧绷，无肉眼可见气泡。具体发酵成熟工艺及取样点见表1。不同取样样品剥皮包装操作包装贮藏、备用，以原料肉为对照。

表1 发酵工艺及取样点Table 1 Fermentation and ripening process and sampling points

1.3.2 萨拉米香肠蛋白质水解变化规律测定

游离氨基酸测定：参考赵见营等[16]的方法采用氨基酸自动分析仪测定样品中的游离氨基酸组成及含量，以干基计。

蛋白质水解指数的测定[17]：蛋白质水解指数/%=非蛋白氮/蛋白氮×100。其中，非蛋白氮及蛋白氮含量均采用全自动凯氏定氮仪测定。

蛋白组分分离[18]：取干燥后肉样20.0 g，加入100 mL溶液A（3.5 mmol/L KH2PO4、15.6 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5），匀浆1 min后于8 000 r/min条件下冷冻离心15 min，重复操作2 次，分离上清液和沉淀；在上清液加入适量TCA，使TCA质量分数为10%，8 000 r/min冷冻离心15 min，上清液为非蛋白氮，收集沉淀即为肌浆蛋白；沉淀部分加入100 mL的溶液B（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4、0.45 mol/L KCl，pH 7.5）并匀浆1 min，8 000 r/min冷冻离心15 min，此提取过程重复操作2 次，合并上清液即为肌原纤维蛋白，沉淀部分为总基质蛋白。向总基质蛋白中添加50 mL浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，搅拌8 h，8 000 r/min冷冻离心15 min，上清液为碱溶蛋白，沉淀部分为碱不溶蛋白。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析：利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度[19]并进行SDS-PAGE分析。其中，分离胶为10%，浓缩胶为5%，用考马斯亮蓝G-250染色。

1.3.3 萨拉米香肠脂质氧化作用测定

通过萨拉米香肠发酵过程中过氧化值（peroxide value，POV）、硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值判断脂质氧化规律，通过提取脂肪分析在萨拉米香肠发酵成熟过程中中性脂质、磷脂、游离脂肪酸的相对含量变化，并采用气相色谱分析仪分析游离脂肪酸组成的相对含量变化，以此确定萨拉米香肠发酵成熟过程中脂质水解规律。

1.3.3.1 脂质氧化测定

POV测定：参照GB/T 5009.37—2003《动植物油脂过氧化值的测定》。

TBARS值的测定[20]：称取5.0 g样品于80 mL离心管中，加25 mL 20% TCA溶液和20 mL H2O，匀浆静置1 h并在2 000×g冷冻离心10 min，过滤并收集滤液，滤液定容到50 mL。取2 mL滤液加2 mL TBA溶液（0.02 mol/L），在沸水浴中充分反应20 min，冷却后用UV-2600紫外-可见分光光度计测定其在532 nm波长处吸光度；空白样：25 mL 20% TCA溶液用双蒸水定容到50 mL，然后取2 mL滤液加2 mL TBA。TBARS值由标准曲线计算，结果以每千克样品中丙二醛质量表示（mg/kg）。

1.3.3.2 总脂肪的提取[21]

取20.0 g样品切碎，称取2.00 g于离心管加入25 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，匀浆60 s转移到带塞量筒中定容至40 mL，静置30 min后过滤，除去其中的蛋白、结缔组织，加入0.22 倍体积的盐水，静置2 h分层或3 000 r/min离心15 min，吸净上层液体（水、甲醇、离子杂质等），将剩余液体转移至平底烧瓶中，用旋转蒸发器在40 ℃水浴条件蒸干溶剂，残留物于-20 ℃贮存备用。

1.3.3.3 脂质分离[22]

称量30～60 mg脂肪，溶解于5 mL的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液中，然后吸取全部液体用100 mg的氨丙基硅柱（VARIAN）分离，首先用5 mL的氯仿-异丙醇（2∶1，V/V）溶液洗出中性脂质，再用5 mL乙醚-乙醇（2∶1，V/V）溶液冲洗出游离脂肪酸，最后一步用5 mL的甲醇-盐酸（9∶1，V/V）溶液洗出磷脂。洗脱过程中分别用干燥并称质量过10 mL离心管收集各部分脂质，用氮气仪吹干其中的溶剂，然后再分别称量，计算各部分脂质占总脂肪的百分含量。

1.3.3.4 游离脂肪酸的测定及气相色谱分析

游离脂肪酸的甲酯化：在提取的1 mg脂肪酸中加入2 mL质量分数10%的三氟化硼-甲醇溶液，加入少量2,2-二甲氧基丙烷作为除水剂，60 ℃水浴30 min。充分冷却后添加1 mL蒸馏水和1 mL正庚烷振荡1 min，静置分层后吸取全部上层有机层，加入十七酸甲酯作为内标物，用氮吹吹干溶剂，用正庚烷定容，以备色谱测定。

气相色谱条件：DB-23色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：90 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至180 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min速率升到240 ℃，保持12 min；载气流速1 mL/s；进样量1 μL，分流比1∶70；进样口温度240 ℃；火焰离子监测器检测温度240 ℃。

1.4 数据处理

采用SPSS 20.0软件处理数据并分析作图，平均值用Duncan多重比较进行差异显著性检验（P＜0.05）（n=3）。

2 结果与分析

2.1 蛋白质水解变化规律

2.1.1 蛋白质水解指数变化

图1 萨拉米香肠发酵成熟过程中蛋白质水解指数变化Fig. 1 Changes in proteolysis index during processing of salami

从图1可以看出，随着发酵成熟时间的延长，原料中蛋白质水解指数显著增加（P＜0.05）。另外，萨拉米香肠在高温发酵阶段蛋白质水解指数显著增加，从10.3%增加至17.7%，是其蛋白质水解的主要阶段，这主要是因为高温发酵阶段微生物的大量生长和该温度条件下组织蛋白酶有更高的活力。在萨拉米香肠的发酵成熟过程中，由于微生物及内源蛋白酶的作用，部分蛋白质不断被水解为肽类、游离氨基酸等风味、滋味物质及其前体物质，构成发酵肉制品的风味体系。随着发酵时间的延长，蛋白质水解指数的增加趋势逐渐降低，这是由于在发酵后期，微生物代谢和pH值处于稳定状态，可有效维持蛋白质的水解速率。

2.1.2 蛋白质组分变化

表2 萨拉米香肠发酵成熟过程中蛋白质组分比较Table 2 Comparison of protein components during processing of salami

从表2可以看出，肌浆蛋白氮和肌原纤维蛋白氮相对含量在发酵成熟过程中不断降低；其中肌浆蛋白氮从21.22%降低至11.35%，高温发酵成熟阶段是萨拉米香肠肌浆蛋白分解的主要时期；对于肌原纤维蛋白氮，在发酵成熟过程中从19.50%降低8.77%，对萨拉米香肠的风味形成有重要的贡献。肌浆蛋白氮和肌原纤维蛋白氮降低主要是因为在微生物及组织蛋白酶的作用下，不断分解为小分子非蛋白类物质，另外内源性蛋白酶在蛋白质降解过程中比微生物分泌的蛋白酶发挥的作用更大，特别是在加工过程的初期，这与Sanz等[23]的研究结果一致。本实验发酵菌种中含有清酒乳杆菌，其对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解有潜在的作用[24]。另外，在萨拉米香肠发酵后期，碱溶蛋白氮增加较显著，碱不溶蛋白氮相对含量无显著变化（P＞0.05）。这是由于发酵成熟条件，导致蛋白质发生变性，逐渐变为碱溶蛋白质，非蛋白氮相对含量及碱溶蛋白氮相对含量的增加也证明了这一点。

2.1.3 不同蛋白质组分电泳结果

根据2.1.2节结果，萨拉米香肠不同蛋白质组分在发酵成熟过程中，肌浆蛋白质和肌原纤维蛋白质不断水解，如图2所示，2 种蛋白质在泳道1和2之间条带无明显的差异，即在脱水阶段蛋白质无明显的分解。对于肌浆蛋白质（图2b），在泳道3～6中，100～120 kDa的条带逐渐变模糊，同理20～25、80～85 kDa附近的条带清晰度也逐渐降低，说明在发酵成熟过程中肌浆蛋白质不断分解；同时，从图2b可以看出，60 kDa以及15 kDa附近的条带逐渐变亮，说明小分子质量的肌浆蛋白质不断累积。从图2a也可以看出，肌原纤维蛋白在发酵成熟过程中也不断分解，表现为120～200 kDa的条带在发酵30 d（泳道5）后条带变细，并且40～50 kDa附近的条带随着发酵时间的延长逐渐变少，说明肌原纤维蛋白和肌浆蛋白在微生物的作用下会生成亲水性的多肽，在发酵成熟中不断分解。

2.1.4 游离氨基酸组成变化

游离氨基酸的释放及分解是发酵肉制品风味及滋味形成的重要来源，主要来源于大分子质量蛋白质及肽类的水解，在萨拉米香肠的发酵成熟过程中蛋白质不断水解，见表3。随着发酵成熟时间的延长，产品中的游离氨基酸总量呈显著的先升高后降低的趋势，尤其是在高温发酵成熟及发酵15 d过程中，产品中大量的游离氨基酸释放并累积，主要是因为微生物对蛋白质的作用，在肽酶的作用下使蛋白质分解产生多肽和各种氨基酸[25-26]；随着发酵时间的延长至发酵45 d成熟阶段，产品中的游离氨基酸总量逐渐降低至1 307.64 mg/100 g，并且除色氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、脯氨酸外，其他游离氨基酸在此过程中呈先增加后降低的趋势。说明在萨拉米香肠的发酵成熟过程中，大分子蛋白质及肽类水解释放的氨基酸进一步发生反应，产生其他小分子物质。这些氨基酸可能是由蛋白水解作用产生的，他们在后期成熟过程中占主导，这对萨拉米香肠发酵风味的形成有一定的贡献[27]。其中，谷氨酰胺代谢产生的谷氨酸在发酵后期大量积累，它能够产生鲜味；综合上述分析可以看出，在萨拉米香肠的发酵成熟过程中，蛋白质水解指数不断增加，表现为肌浆蛋白质和肌原纤维蛋白质相对含量逐渐降低，并且在高温发酵成熟及发酵15 d的成熟阶段是蛋白质水解和游离氨基酸总量累计的主要阶段。另外，随着萨拉米香肠进入发酵阶段时，蛋白质水解指数变化逐渐升高，并且游离氨基酸总量也相应升高。

表3 萨拉米香肠发酵成熟过程中游离氨基酸变化Table 3 Changes in free amino acids during processing of salami mg/100 g

2.2 脂质氧化作用

2.2.1 脂质组成变化

表4 萨拉米香肠发酵成熟过程中脂质相对含量组成Table 4 Change in lipid composition during processing of salami%

在萨拉米香肠发酵成熟过程中，由于微生物及脂肪水解酶的分解作用，产品中的脂质组成也会不断发生变化。从表4可以看出，产品中的中性脂质及游离氨基酸的相对含量不断增加，而磷脂的相对含量不断降低。在发酵成熟后期，产品中的3 种脂质成分变化趋势逐渐减少。结果表明，在萨拉米香肠发酵成熟过中，在微生物以及中性脂酶、酸性脂酶、磷脂酶等内源酶的作用下，脂质不断水解，将多肽降解生成游离脂肪酸，导致游离脂肪酸相对含量不断增加。这可能是乳酸菌作用形成风味的主要途径[28]。本实验采用的一种发酵菌种为木糖葡萄球菌，有研究显示葡萄球菌具有较强的分解脂肪能力[29]，对发酵香肠独特风味的形成发挥了重要作用，成为香肠的“风味菌”，这也说明了木糖葡萄球菌对萨拉米香肠发酵过程风味的形成具有重要作用。

2.2.2 游离脂肪酸组成变化

表5 萨拉米香肠发酵成熟过程中游离脂肪酸组成Table 5 Change in free fatty acids composition during processing of salami mg/kg

在发酵肉制品中的游离脂肪酸主要包含了饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA），是构成产品滋味和形成产品风味的重要原料。从表5可以看出，随着发酵成熟过程的进行，SFA和MUFA均呈显著增加趋势，PUFA呈现上升后下降的趋势。对于饱和脂肪酸，除二十碳酸外，其余饱和脂肪酸在发酵过程中的含量不断增加；对于不饱和脂肪酸，除油酸和鳕油酸外，其他不饱和脂肪酸的含量均呈现先升高后降低的过程。主要是因为在发酵成熟前期，产品中的脂质不断水解；随着发酵成熟过程的进行，大量不饱和脂肪酸发生氧化生成脂质羰基化合物，同时产生醇类、醛类和酮类等化合物，能通过自由基链反应形成过氧化物，这些次级反应产生大量挥发性化合物，从而导致不饱和脂肪酸的含量不断降低。

2.2.3 脂质氧化变化

萨拉米香肠发酵成熟过程中，在脂肪氧合酶及活性自由基的作用条件下，大量的不饱和脂肪酸被氧化成其他小分子烃类、醛类、醇类及酮酸类等成分，是形成产品风味和滋味的重要物质。从图3可以看出，产品POV及TBARS值均呈显著先增加后降低的趋势（P＜0.05）。可能是在发酵前期，乳酸菌快速生长繁殖，消耗氧产生大量乳酸[30]，形成缺氧的低酸环境，降低了脂肪酸氧化反应速度；发酵前中期，随着pH值的缓慢回升和亚硝酸钠的减少，脂肪氧化速度增加；在发酵后期，可能由于pH值回升和微生物分布的改变，脂肪氧化产生的醛类物质发生了其他的化学反应，从而导致TBARS值的下降[31]。但不同的是，POV最高点出现在发酵成熟的15 d时，而TBARS最高值出现在发酵30 d时；随着发酵时间的继续延长，产品POV及TBARS值均有显著（P＜0.05）降低趋势。在发酵成熟结束后，产品POV和TBARS值分别为0.083 2%和0.38 mg/kg。

图3 萨拉米香肠发酵成熟过程中脂质氧化变化Fig. 3 Changes in lipid oxidation during processing of salami

综上分析可以看出，在萨拉米香肠发酵成熟过程中，中性脂质及游离脂肪酸相对含量显著增加，而磷脂相对含量不断降低；在不饱和脂肪酸中，除油酸和鳕油酸外，其余脂肪酸在发酵成熟过程中均呈现先升高后降低的趋势，并且该趋势与POV及TBARS值的变化趋势相同。

3 结 论

在萨拉米香肠的发酵成熟过程中，高温发酵成熟及发酵15 d的成熟阶段是蛋白质水解和游离氨基酸总量累计的主要阶段，这主要是因为高温发酵阶段微生物的大量生长和该温度条件下组织蛋白酶有更高的活力。另外，随着发酵成熟进入发酵第45天时，游离氨基酸总量略降低但与发酵中期总量差异性不显著。中性脂质及游离脂肪酸相对含量显著增加（P＜0.05），而磷脂相对含量不断降低；在不饱和脂肪酸中，除油酸和鳕油酸外，其余脂肪酸在发酵成熟过程中均呈现先升高后降低的趋势，并且该趋势与脂质氧化（POV、TBARS值）的变化趋势相同。因此，萨拉米香肠发酵成熟过程中脂质水解及氧化的发生是同步的。其中，在萨拉米香肠发酵过程中，清酒乳杆菌对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解有潜在的作用，木糖葡萄球菌具有较强的分解脂肪能力，对发酵香肠独特风味的形成发挥了重要作用，成为香肠的“风味菌”。