两个‘黄冠梨’杂交F1代对白粉病抗性的遗传倾向

张艳杰，王 斐，欧春青，方 明，赵亚楠，马 力，姜淑苓

(中国农业科学院果树研究所/农业部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100)

梨是蔷薇科(Rosaceae)、梨属(Pyrus)水果作物，可分为亚洲梨和欧洲梨[1]，生产上的栽培品种主要属于白梨(P.bretschneideri)、秋子梨(P.ussuriensis)、砂梨(P.pyrifolia)、新疆梨(P.sinkiangensis)和西洋梨(P.communis)等[2]。

白粉病是梨树叶部主要病害之一，在中国各主要梨区均有发生，且近几年有加重的趋势，发生严重时，对叶片光合作用和蒸腾作用影响极大，造成叶片提早脱落，严重影响树势和产量[3]。梨树白粉病病原菌有白叉丝单囊壳(Podosphaeraleucotricha)[4-5]、隐蔽叉丝单囊壳(P.clandestina)[6]、P.paracurvispora[7]和梨球针壳(Phyllactiniapyri)[8]等。

培育和栽植抗白粉病品种，是防治梨树白粉病最根本、最有效的措施，但是梨树童期较长，杂交育种的选择周期长，对于抗病性等特征进行分子辅助育种的早期筛选，可以降低后期性状观察的工作量，甚至缩短育种进程[9]。本研究以田间自然发病抗性调查为基础，评价‘早酥梨’ב黄冠梨’和‘锦丰梨’ב黄冠梨’两个杂交组合F1代对梨树白粉病的抗性，并分析白粉病抗性遗传倾向，筛选抗病材料，旨在为梨树抗病新品种选育提供科学依据，为梨树抗白粉病相关基因鉴定和定位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 梨树杂交组合材料

试验材料‘早酥梨’ב黄冠梨’和‘锦丰梨’ב黄冠梨’两个杂交组合F1代定植于中国农业科学院果树研究所(兴城)，常规管理。

1.2 梨树白粉病病原菌鉴定

当梨树白粉病叶片产生黑色小颗粒(子囊果)时，采集梨树白粉病叶片，显微镜下观察黑色小颗粒的形态特征，初步进行白粉病菌的形态鉴定；刮取病叶上的白粉病菌，采用Chelex-100法提取白粉病菌DNA，以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增[10]，将扩增片段进行测序，并将测序结果在NCBI上进行BLAST比对，以对白粉病菌进行分子鉴定。

PCR反应体系为25 μL，其中：DNA模板溶液(50 ng/μL)2 μL，10×Taq10 buffer(Mg2+plus) 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs溶液0.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，Taq10 DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至25 μL。

扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3 梨树白粉病田间调查

分别于2017年9月和2018年9月进行两个黄冠梨杂交组合F1代田间白粉病自然发病调查，单株调查叶片100个，根据白粉病病斑面积占叶片总面积的百分比记录病级。分级标准[11]为：0级，无病斑；1级，病斑面积在5%及以下(0除外)；2级，病斑面积在5%以上，15%及以下；3级，病斑面积在15%以上，30%及以下；4级，病斑面积在30%以上，45%及以下；5级，病斑面积在45%以上，65%及以下；6级，病斑面积在65%以上，85%及以下；7级，病斑面积在85%以上。感病指数(SI)按照以下公式计算：

感病指数(SI)=∑(病级代表值×该级病叶数)/(调查总叶数×最高级代表值)×100

最后取两年感病指数的平均值，进行数据分析，根据叶片感病指数，评价梨树对白粉病的抗性程度[11]：SI=0，不感病(I)；0

1.4 杂交后代抗白粉病遗传倾向分析

将亲本和杂交F1代两年的白粉病调查数据录入Excel表格，进行数据分析，计算感病指数，取两年的平均值，并用平均值进行以下分析，计算杂交F1代群体感病指数的中亲值(MP)、变异系数(CV)、遗传传递力(Ta)、优势率(H)等，分析F1代对白粉病抗性的遗传倾向[12]。

变异系数(CV)=标准差/F×100%；遗传传递力(Ta)=F/MP×100%；优势率(H)=F-MP/0.5(P1+P2)×100%。(公式中的F为杂交后代平均值，MP为中亲值，P1和P2为亲本值)

2 结果与分析

2.1 梨树白粉病病原菌鉴定

显微形态观察显示，梨树白粉病病原菌子囊果扁圆球形，黑褐色，无孔口，附属丝针状，基部膨大呈球形，子囊内有2个子囊孢子，子囊孢子长椭圆形，单胞，无色或淡黄色，具有典型梨球针壳(P.pyri)的特征[6](图1)，将梨树白粉病菌初步鉴定为梨球针壳(P.pyri)。扩增白粉病菌ITS片段获得一段679 bp的序列，在NCBI上进行BLASTn比对发现，该序列与P.pyri的ITS序列(GenBank GU984780.1)一致性为99%。综合形态和分子鉴定结果，将梨树白粉病菌鉴定为梨球针壳(P.pyri)。

2.2 杂交F1代白粉病抗性分析

2017年和2018年试验地梨树白粉病发生较严重且均匀，感病对照‘苹果梨’的发病率分别达到96%和93%，感病指数分别达到63.78和 62.78，平均感病指数为63.28±0.71。‘早酥梨’ב黄冠梨’杂交F1代实生树215株，白粉病发病率达到100%，感病指数最低为0.14±0.20，最高为 77.71±8.08，平均为23.59±3.03，抗病植株数量最多，为71株，占33.02%，其次为高抗植株62株，占28.84%，高感植株有38株，占 17.67%；‘锦丰梨’ב黄冠梨’杂交F1代实生树362株，白粉病发病率为98.34%，感病指数最低为0，最高为62.43±12.32，平均为15.17± 4.71，高抗植株数量最多，为151株，占41.71%，其次为抗病植株112株，占30.94%，高感植株有20株，占 5.52%，还存在6株不感病植株(表1，表2)。‘早酥梨’ב黄冠梨’杂交F1代群体中，不感病、高抗和抗病植株比例为61.86%，而‘锦丰梨’ב黄冠梨’杂交F1代群体中，不感病、高抗和抗病植株比例达到74.31%；说明‘黄冠梨’的抗白粉病特性对F1代的影响较大(表2)。

2.3 杂交F1代白粉病抗性遗传倾向分析

‘早酥梨’两年平均感病指数为58.44± 2.83，对白粉病高感，‘黄冠梨’两年平均感病指数为 20.50±1.33，抗白粉病，‘早酥梨’ב黄冠梨’杂交F1代群体感病指数均值为23.59±3.03，低于中亲值，遗传传递力为59.78%，变异系数为 92.31%，F1代分离广泛，F1代低于低亲值的实生树118株，占54.88%(表3)。‘锦丰梨’两年平均感病指数为33.23±3.30，感白粉病，‘锦丰梨’ב黄冠梨’杂交F1代群体感病指数均值为 15.17±4.71，低于中亲值，甚至低于低亲值，低低亲植株有257株，占70.99%，表现出低低亲遗传倾向，遗传传递力为56.46%，变异系数达到 111.16%，后代分离极其广泛(表4)。两个‘黄冠梨’杂交组合的F1代群体均表现出低亲遗传倾向，即倾向于‘黄冠梨’的抗病遗传。

A.感染梨树白粉病的叶片 The leaf symptoms of pear powdery mildew；B、C.梨树白粉病菌的子囊果 The ascocarp of pear powdery mildew pathogen；D.梨树白粉病菌的子囊 The asci of pear powdery mildew pathogen

图1 梨树白粉病叶片症状和病菌特征Fig.1 Leaf symptoms and pathogen characteristics of pear powdery mildew

表2 两个‘黄冠梨’杂交组合后代对白粉病不同抗病程度植株的数量Table 2 The number of different resistance plant to pear powdery mildew in two ‘Huangguanli’ hybridized combinations

表3 ‘早酥梨’ב黄冠梨’杂交组合后代对白粉病抗性的遗传变异Table 3 The hereditary variation on the resistance to pear powdery mildew of ‘Zaosuli’בHuangguanli’ hybridized combinations

表4 ‘锦丰梨’ב黄冠梨’杂交组合后代对白粉病抗性的遗传变异Table 4 The hereditary variation on the resistance to pear powdery mildew of ‘Jinfengli’בHuangguanli’ hybridized combinations

3 讨论与结论

梨树白粉病病原菌白叉丝单囊壳(P.leucotricha)也是苹果白粉病病原菌[13]，研究表明苹果白粉病抗性属于多基因控制的数量性状遗传[14]，目前，源于Malusrobusta的Pl1[15]和源于M.zumi中的Pl2[16]是应用于苹果抗白粉病育种的主要基因，对苹果白粉病抗性基因的QTL作图也在研究中[13,17]。但当前国内外缺乏梨树抗白粉病基因筛选和QTL定位的相关研究，在梨树抗白粉病种质资源检测方面，Serdani等[18]检测了31个亚洲梨栽培种和122个欧洲梨栽培种对白叉丝单囊壳(P.leucotricha)的抗性，发现在温室中，95%的欧洲梨和38%的亚洲梨易感染白粉病，在田间，42%的欧洲梨和23%的亚洲梨易被白叉丝单囊壳(P.leucotricha)感染。欧洲梨白粉病病原菌以白叉丝单囊壳(P.leucotricha)为主，但是目前中国梨树白粉病病原菌报道较多的是梨球针壳(P.pyri)[8]，且近几年梨树白粉病有加重的趋势，因此对中国梨树种质抗白粉病特性以及梨树抗白粉病基因QTL定位的研究亟待进行。笔者田间调查和鉴定发现，调查地区梨树白粉病病原菌为梨球针壳(P.pyri)，未发现其他白粉病菌，而且‘黄冠梨’对白粉病表现抗病，‘早酥梨’表现高感，‘锦丰梨’表现为感病，因此，选择‘早酥梨’ב黄冠梨’和‘锦丰梨’ב黄冠梨’两个杂交组合F1代作为研究对象。目前，没有梨树白粉病病害分级的相关报道，由于梨树与苹果树高度同源，本研究参照苹果白粉病病害分级方法进行梨树白粉病的分级和抗病程度的分级。通过对‘黄冠梨’两个杂交组合F1代白粉病的调查，发现‘早酥梨’ב黄冠梨’和‘锦丰梨’ב黄冠梨’两个杂交组合F1代白粉病发病率分别达到100%和98.34%，白粉病感病指数最高达到77.71± 8.08，遗传变异分析显示，黄冠梨两个杂交组合F1代群体均具有低亲遗传倾向，即具有抗病遗传倾向，且在两个杂交组合F1代中，高抗和抗病植株比例均较高，从中筛选到抗白粉病品种的概率较高。本研究结果为进一步分离鉴定梨白粉病抗病基因，构建白粉病抗病基因QTL定位图谱奠定了基础。