红松种子园种群表型多样性研究

童跃伟,唐 杨,陈 红,张 涛,左 江,吴 健,周 莉,周旺明,于大炮,代力民,*

1中国科学院森林生态与管理重点实验室(沈阳应用生态研究所),沈阳 110016 2 中国科学院大学,北京 100049 3 黑龙江省重点国有林管理局,虎林 158402 4 吉林省林业勘察设计研究院,长春 130022

遗传多样性为物种涵盖的种群间和种群内个体间遗传变异的总和,包括表型、细胞学、生化和分子等多层次遗传变异[1]。其中表型是各种形态特征的组合,是生物受制于生态环境条件的遗传变异的表征[2],其表型变异是遗传多样性研究的重要内容[3-4]。同时,利用表型性状研究遗传多样性也最为简便、快速和经济, 可以直观的揭示种群的遗传结构与变异大小, 是遗传育种工作的基础[5-6]。国内外学者利用表型性状对思茅松[7]、五角枫[8]、云南松[9]、闽楠[10]、拟南芥[11]等植物种群进行了遗传多样性分析与评价, 阐明了种群变异结构、来源和规律,为相关树种的资源收集、保护或遗传改良奠定了基础。

红松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)隶属于松科(Pinaceae)松属(Pinus),是我国东北珍贵而稀少的常绿乔木[12]。近百年来,由于过量采伐红松天然林,致使红松资源锐减[13],已被国家二级保护植物[14]。因此,为保护红松种质资源,国家从20世纪80年代中期开始在东北地区不同区域建立红松种子园(例如露水河红松种子园)[15],然而,这批种子园的建园材料是只经过表型性状初选的优树,其选育的遗传基础鲜有报道。以往有人利用分子技术从遗传多样性方面进行了这方面的研究[16- 18],但从表型性状方面还未开展过相关研究。因此,本研究采用表型性状,针对种子园收集的不同区域红松的遗传多样性进行评估,为以后红松种子园资源收集和育种策略提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 实验地概况

吉林省露水河红松种子园,位于东经127°47′,北纬42°28′,海拔760—800 m,属季风性中温带气候类型。该红松种子园于1988年定植,种子园内红松由小兴安岭、完达山、张广才岭和长白山地区共17个种源地的优良无性系组成。采用完全随机排列设计,株行距3 m×3 m,建成红松无性系种子园1个大区,17个小区,共660个无性系,面积16.33 hm2。

1.2 材料来源和样品采集

于2017年8月和10月对种子园内6个种群红松的完整叶片和成熟球果进行采集和形态数据测定工作。采样种群的原产地分别为：吉林省露水河和黄泥河;黑龙江省大海林、东方红、带岭和丰林,该6个种群代表了我国红松不同的自然分布区,而且能反映出分布区的特点(图1)。每种群选取30个单株进行调查和采样,单株间距50 m以上,保证取样均匀性,最大限度降低母树间的亲缘关系。

图1 种子园红松6个种群的原产地分布图Fig.1 Map illustrating the original location of six Pinus koraiensis populations in the seed orchard

1.3 表型性状的测定

从采样单株上随机采集并测量无病虫害、生长旺盛、完整的两年生针叶10束和成熟的球果10个,选择了15个易于获取和测定的遗传上相对稳定的表型性状,用游标卡尺(精确到0.01 mm)分别测定并记录红松的针叶长(NL)、针叶粗(NW)、针叶束粗(FW)、球果长(CL)、球果宽(CD)、种子长(SL)、种子宽(SD),用电子天平(精确到0.01g)分别称量单个球果重量(CW)、单果产种量(CSY)和百粒重(HSW),其中百粒重随机3次重复测量100粒种子,然后计算出针叶长/针叶粗(NL/NW) 、针叶束粗/针叶粗(FW/NW)、球果长/球果宽(CL/CD)、产种率(CSY/CW) 和种子长/种子宽(SL/SD),精确到0.01。

1.4 数据处理与分析

红松种群的表型变异特征采用巢式设计方差分析[1, 3],线形模型为:Yijk=μ+Si+T(i)j+(ij)k,式中Yijk为第i个种群第j个个体第k个观测值,μ为总均值,Si为种群效应(固定),T(i)j为种群内个体效应(随机),(ij)k为试验误差。同时进行多重比较和差异性检验, 分别计算6个种群各个性状的平均值(X)、标准偏差(SD)、和变异系数(CV),CV=SD/X。为了与基因分化系数(Gst)相对应,按下式计算出了反映种群间表型分化的值定义：Vst=(2t/s)/ (2t/s+2s),式中2t/s为种群间方差分量、2s为种群内方差分量,Vst为表型分化系数,表示种群间变异占遗传总变异的百分比,表明表型变异在种群间贡献的大小[19]。基于15个性状数据,对6个红松种群进行非加权组平均法(UPGMA)聚类分析[20]。

数据经Excel 2016整理后, 巢式方差分析、表型性状的平均值、标准差和变异系数、差异性检验和多重比较和表型分化系数均在R 3.2.5中完成,聚类分析在SPSS19.0中完成。

2 结果与分析

2.1 种群间和种群内的表型变异

对种子园红松6个种群15个表型性状进行巢式设计方差分析(表1),红松15个表型性状在种群间和种群内均差异显著(P<0.01),表明红松的表型性状在种群间和种群内存在广泛的变异。对各种群均值进行Turkey ′s多重比较,发现红松15个表型性状在种群间存在广泛的变异,但不同性状在各种群间变异式样不同(表2)。针叶性状中NL、NW和FW在种群间差异显著,露水河种群最大,分别为12.65 mm、0.99 mm、2.02 mm；东方红种群NL最小,仅为11.1 mm；带岭种群的NW和FW最小。NL/NW和FW/NW代表针叶的叶型指数,这两种性状最大的是带岭种群,分别为 14.24和2.08。6个球果性状中CL、CD和CL/CD在种群间的差异都较小,变异的范围分别为14.27—15.35 cm、9.46—10.04 cm和1.42—1.56；然而CW和CSY这两个球果的质量性状在种群间的差异较大,露水河种群最大,分别为298.33 g和89.13 g；带岭种群最小,分别为235.99 g和68.9 g。CSY/CW变异范围为28.77—34.03。同时, 红松4个种子性状在种群间的差异也较小,SL、SD和HSW均值最大的是露水河种群(17.29 mm、11.29 mm和69.93 g)。

从各种群的地理分布来看,不同性状在种群间多表现为显著性差异。在所测的15个表型性状中,露水河种群在其中10个表型性状均值上表现出最高值,其位置为最南端,即纬度最低；而在6个种群中出现低值的种群则比较分散。

2.2 表型性状的分化

根据巢式方差分析结果,各性状方差分量和表型分化系数分析见表3,15个表型性状种群间的方差分量占总变异的百分比波动于0.62%—29.95%,平均为9.28%；种群内的方差分量占总变异的百分比为31.81%—89.07%,平均为65.11%；随机误差的方差分量百分比为9.03%—67.57%,平均为25.61%。各性状种群内的方差分量均大于种群间的方差分量,说明种群内的变异是红松表型总变异的主要部分。

表1 红松种子园种群间和种群内方差分析结果

NL: Needle Length; NW: Needle Width; FW: Fascicle Width; NL/NW: Ratio of Needle Length to Needle Width; FW/NW: Ratio of Fascicle Width to Needle Width; CL: Cone Length; CD: Cone Diameter; CL/CD: Ratio of Cone Length to Cone Diameter; CW: Cone Weight; CSY: Seed Yield of Cone; CSY/CW: Ratio of Seed Yield of Cone to Cone Weight; SL: Seed Length; SD: Seed Diameter; SL/SD: Ratio of Seed Length to Seed Diameter; HSW: Hundred Seed Weight.

表2 种子园6个红松种群间表型性状的平均值及其多重比较(Turkey,a=0.05)

Table 2 The mean value, standard deviation and multi-comparison of phenotypic traits among sixP.koraiensispopulations in seed orchard(Turkey,a=0.05)

表型性状Phenotypic traits露水河黄泥河大海林东方红带岭丰林针叶长(NL)/cm12.65±1.36c11.41±1.11ab11.33±1.33ab11.1±1.36a11.47±1.62b11.52±1.56b针叶粗(NW)/mm0.99±0.12d0.91±0.11b0.94±0.12c0.91±0.1b0.81±0.11a0.83±0.11a针叶束粗(FW)/mm2.02±0.21d1.87±0.2b1.95±0.23c1.87±0.19b1.68±0.17a1.69±0.2a针叶长/针叶粗(NL/NW)12.84±1.33c12.66±1.53bc12.11±1.31a12.34±1.46ab14.24±2.05d13.97±2.08d针叶束粗/针叶粗(FW/NW)2.04±0.13a2.07±0.17ab2.07±0.14ab2.08±0.16ab2.08±0.22b2.05±0.2ab球果长(CL)/cm15.35±1.55b14.7±1.74ab14.59±1.45a14.67±1.55a14.27±1.92a14.63±1.76a球果宽(CD)/cm10.04±0.6b9.46±1.06a9.88±0.62b9.97±0.76b10.03±0.87b9.96±0.92b球果长/球果宽(CL/CD)1.53±0.13c1.56±0.14c1.48±0.11b1.47±0.1b1.42±0.12a1.47±0.14ab球果重(CW)/g298.33±65.74c250.83±72.6ab245.92±62.15ab269.29±66.21b235.99±78.62a237.01±72.57a单果产种量(CSY)/g89.13±27.82b77.62±21.68ab81.82±18.33bc83.65±22.14bc68.9±29.27a78.35±30.09ac产种率(CSY/CW)29.48±5.76a31.23±3.96ab34.03±6.44b31.45±5.79ab28.77±8.48a32.45±7.62b种长(SL)/mm17.29±0.92b16.31±1.4a17.07±1.05b16.11±0.11a16.9±1.31b17.25±1.46b种宽(SD)/mm11.29±0.85b11.21±0.88ab10.96±0.88a10.93±0.9a11.0±0.93a10.94±1.06a种长/种宽(SL/SD)1.54±0.13b1.46±0.12a1.56±0.12b1.48±0.12a1.54±0.14b1.58±0.13b百粒重(HSW)/g69.93±7.25b62.65±11.84a64.63±8.8a65.32±9.24a65.64±10.7ab64.43±13.49a

同时,针叶、球果和种子性状Vst的变异幅度为0.95%—35.67%,15个表型性状的平均表型分化系数为12.39%,说明红松种子园种群表型变异在种群间的贡献占12.39%,种群内贡献占87.61%,种群内多样性大于种群间多样性。其中表型分化系数最大的性状为FW,为35.67%；其次为NW,为33.27%,最小的为FW/NW,为0.95%,15个表型性状均表现为种群间的表型分化系数低于50%,说明红松种子园种群表型变异主要存在于种群内。

表3 红松种子园种群表型性的方差分量及表型分化系数

2.3 表型性状的变异特征

不同性状在6个种群中的变异情况有显著差别(表4),各性状在种群内的总平均变异系数为13.28%,变幅为6.16%—31.48%,在15个表型性状中球果单果产种量的变异系数最大(CV=31.48%),其次为单果的球果重和出种率,变异系数分布为27.46%和20.42%,这3个性状变异程度明显高于其他性状,表明球果性状的质量性状变异较其他性状变异大,较其他性状的稳定性差。此外,分别计算红松种群内针叶、球果和种子3个生物学性状的平均变异系数,得出球果的平均变异系数最大(CV=17.86%)、其次为针叶性状 (CV=11.19%),种子性状的变异系数最小(CV=9.87%),进一步说明种子性状较其他性状的稳定性高,而球果性状的稳定性最差。

表4 红松6个种群表型性状的变异系数(CV)

图2 种子园红松6个种群15表型性状的聚类树形图Fig.2 UPGMA cluster based on 15 phenotypic traits of six P. koraiensis populations

此外,种子园红松同一性状在不同种群间的变异系数也有一定差异,平均变异系数范围为11.79%—15.77%,带岭和丰林种群的性状平均变异系数要高于其他种群,说明带岭和丰林种群的表型多样性程度高于其他种群。由于种子园地处相同的环境,因此可以说明的是种子园不同种群的基因型不同,从而导致了种群表型变异的差异。因此,可以推断出带岭和丰林地区的红松基因型的多样性也高于其他种群。

2.4 表型性状的聚类分析

采用欧式平均距离UPGMA聚类方法对6个种群的15个表型性状数据进行聚类分析(图2),当欧式平均距离的阈值为2时,6个种群明显分化为4类,第一类为露水河种群,第二类为东方红种群,第三类为黄泥河种群和大海林种群,第四类为带岭和丰林种群。聚类结果与种子园6个种群的地理距离相一致,聚类出4大类群与我国东北地区地形有一定程度的契合,露水河种群隶属长白山山脉,东方红种群为完达山山脉,黄泥河和大海林种群属于张广才岭山脉,而带岭和丰林种群坐落于小兴安岭山脉,当从而验证了山脉形成地理隔离,从而导致物种遗传变异和分化的理论。

3 结论与讨论

3.1 红松不同种群表型变异来源

通过对露水河种子园的6个种群的针叶、球果和种子的15个表型性状的研究发现,红松的表型性状在种群间和种群内都存在极显著的差异。这种变异在松树中广泛存在,如海岸松[21]、欧洲赤松[22]、思茅松[7]等,显著的表型差异暗示红松存在丰富的遗传变异。表型变异的结论与诸多遗传多样性的分析结论一致,即红松种群遗传多样性比较丰富[23- 25],李斌等对松属植物遗传分化进展的研究得出了相似的结果[4]。

红松15个表型性状的平均分化系数Vst=12.39%,说明种群内变异(87.61%)显著高于种群间变异(12.39%),种群内变异是红松的主要变异来源,这反映了种群G×E的复杂性及其适应特殊环境选择压的广泛程度,由于种子园6个红松种群地处相同的生态环境,故其表型性状之间的变异主要是来源于遗传方面所造成。与其他针叶树种的分化比较,红松表型性状的分化处于中等水平,高于西特喀云杉(10.1%)[26]、花旗松(11.1%)[27]和马尾松(6.44%)[19],却低于油松(38.97%)[28]、云南松(25.27%)[9]和白皮松(22.86%)[3]等。有研究表明,红松的繁育系统可能是红松种群内变异的主要来源,繁育系统是影响物种种群遗传结构的关键因素,尤其是交配系统和基因流[29]。例如,针叶树花粉的迁移距离很大,外部花粉(基因)的迁入减少了种群间的差异[30]；典型的异花授粉植物的交配系统可以促进种群间的基因交流,增加有效种群大小,减少基因漂变对遗传结构的影响[29]；红松为风媒异花授粉的裸子植物,具备远距离扩散种子的可能,可以促进基因流的流动,从而减少种群间的差异[31]。尽管种群内的变异远远大于种群间的变异,但种群间变异的意义却大于种群内变异,因为存在于种群间的变异反映了地理、生殖隔离上的变异,种群间的多样性变异是种内多样性的重要组成部分[32]。

3.2 红松不同种群表型变异特征

植物种群中变异系数是衡量各观测值离散程度的统计量,变异系数的大小可间接反映出种群的表型多样性丰富程度,即变异系数大说明该种群的性状变异幅度高,表型多样性丰富,可能存在的遗传变异越丰富,种群内多种基因型所对应的表型范围越广,可以使种群整体更加适应环境的变化[33]。本研究中红松15个表型性状中的变异系数幅度为6.16%—31.48%,平均 13.28%,变化范围较大,说明红松种群内表型性状遗传变异较丰富。其中球果变异系数(17.86%) >针叶变异系数(11.19%) >种子变异系数 (9.87%),可以看出营养性状的变异水平大于繁殖性状的变异水平,营养性状变异更丰富。研究表明,环境变化容易引起植株的高矮、叶片的长短等营养性状的变化,而繁殖器官的变异则经历了较为复杂的发育分化后改变较少,环境的不同是导致营养器官变异的主要原因[8]。红松种子的稳定性最大,在一定程度上可以反映红松遗传变异的程度越小,红松种子是传递遗传物质的载体,变异较小,稳定性较高,受到环境影响较小。同时,单个球果重量、单果产种量和百粒重的变异幅度明显大于其他表型性状,这3个表型性状有可能主导红松发生表型变异的方向,球果质量和千粒重对植物的成功定居有重要的影响[34]。

3.3 红松不同种群表型分化的地理变异规律

种群的分布以及UPGMA聚类结果表明,红松表型按照地理距离而聚类,聚类出的4四大类群与我国东北地区地形有一定程度的契合,带岭和丰林种群、黄泥河和大海林种群分布区域距离较近,且分别属于小兴安岭山脉和张广才岭山脉,东方红种群属于完达山山脉,露水河种群属于长白山山脉,因而利用地理区划对红松表型进行划分是可行的。一般来说植物表型性状的地理变异规律比较复杂,几乎都是由环境和基因型共同决定的,因物种的不同而异,如野生玫瑰表型性状主要依地理位置而聚类[35],而五角枫性状的表型特征没有依地理距离而聚类[8]；川西云杉表现出以经度和纬度并存的变异模式[36],而浙江楠却呈现出以海拔变异为主的梯度规律性[5]。但本研究所选的6个种群已经排除了环境因素的干扰,其山脉划分的依据主要是遗传方面即基因型不同导致的原因。种子园6个红松种群的产地中,地处相同山脉的水热条件极为相似,基因交流还能正常进行；而在不同山脉间已经产生地理隔离,造成基因交流障碍,突变成不同的基因型,因此红松表型性状表现出以山脉变异的规律性。另外,本研究结果在利用分子手段研究红松的遗传变异方面得到了验证,如红松各种源在遗传多样性方面的差异与其地理分布明显相关,其中小兴安岭种群的遗传多样性较高,且与张广才岭种群遗传距离较近,而与长白山种群和老爷岭种群遗传距离较远[24, 37]。但也有研究认为红松不同种源的遗传距离和地理距离相关性不明显,造成这一现象的原因是与红松不同种群分布区特定的地理、气候等因子有关,地理距离相近的种群之间可能存在某种特定的隔离机制,阻碍基因交流；此外,还可能与种群之间不同的形成机制和演化历史有关[17, 25]。因此,有待进一步验证。

3.4 红松保护对策与建议

红松为我国二级保护珍贵用材树种,通过长期的地理隔离、自然选择和人工选择,产生了极其丰富的表型变异,这些表型性状的变异都是基因型和环境因子共同作用的结果,表型变异越大,可能存在的遗传变异就越大。目前,由于红松天然林面积不断减少,破坏极为严重,因此就红松的保护和发展提出如下建议：(1) 本文结论之一就是红松种群遗变异比较丰富,在松属植物中属于中等水平。因此加强现有天然林的保护,禁止采伐天然林保留林木,同时保护其生境,对维持红松遗传多样性水平至关重要；(2) 根据本文中红松15个表型性状在种群间和种群内均存在着极显著的差异,并且遗传变异主要存在于种群内的结论,应以种群为单位,开展红松种群生态遗传学研究,分析红松种群的遗传多样性,结合分子生物学分析红松濒危的关键因子和濒危过程；(3) 带岭和丰林种群表型性状遗传多样性要高于其他种群,因此可选择一定数量的林分优先进行原地保存,同时利用与异地保存相结合的手段,营建红松母树林、种子园和收集圃等,从而对红松基因库保存提供有利保障。