小鼠急性酒精性肝损伤过程中热休克蛋白Gp96的表达变化及意义

宋 影， 李三强， 田张钰， 李子昂， 代新华， 王玉东， 苏立鹏， 宋晓改， 朱文枫， 杨 欢

河南科技大学医学院肝损伤与修复分子医学重点实验室，河南 洛阳 471003

急性酒精性肝损伤是指短时间内摄入大量酒精，致使血液中酒精浓度超肝脏的代谢能力而引起的肝细胞受损等一系列改变[1]。随着现代人们交际应酬中酒的消耗增多，酗酒人数逐年增加，酒精性肝病(alcoholic live disease，ALD)的发病率也在逐年增高，对人们的身心健康造成了严重威胁[2-3]。热休克蛋白Gp96(glycoprotein of 96 kD，又称grp94、Hsp90b1)属于热休克蛋白90(HSP90)家族的一员，正常条件下定位于细胞内质网膜上。其生物学功能主要为分子伴侣及介导机体免疫应答[4]。近年来随着对Gp96研究的不断深入，人们发现它不仅可以作为免疫佐剂发挥作用，且具备独特的抗肿瘤免疫功能，在抗肿瘤免疫及疫苗制备中都具有很大的应用。又有文献报道，Gp96表达水平与肿瘤大小和分化程度呈正相关，是肿瘤预后诊断的重要标志物[5]。但Gp96在急性酒精性肝损伤过程中的作用并不明确。急性酒精性肝损伤造模与现代人豪饮导致的肝损伤相似[6]，因此本实验通过小鼠白酒一次性灌胃[7]，检测不同时间点小鼠肝脏热休克蛋白Gp96的表达变化，探讨Gp96在急性酒精性肝损伤中的作用及意义。

1 材料与方法

1.1 材料动物：雄性健康清洁级昆明小鼠50只，体质量(20±2)g，由河南科技大学动物实验中心提供。试剂[8]：红星二锅头白酒(56度)，北京红星股份有限公司出产；抗Gp96单克隆抗体，Santa Cruz公司生产；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司生产；苏木素伊红，北京索莱宝科技有限公司；ALT检测试剂盒，浙江伊利康生物科技有限公司。仪器：CX31RBSF光学显微镜，奥林巴斯(中国)有限公司；君意300C电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；日立全自动生化分析仪7180；ST-250制冰机，北京恒光信息技术有眼公司；ST40离心机，美国热电公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备[8]：选取健康昆明雄性小鼠50只随机分为2组：正常组(n=10)、实验组(n=40)。正常组小鼠不做处理，实验组小鼠酒精灌胃(56度红星二锅头，16 ml/kg)诱导小鼠急性肝损伤，分别于一次性酒精灌胃后6、12、18和24 h将各组小鼠摘眼球采血，分离血清(5 000 r/min，20 min)，颈椎脱臼处死小鼠并分离提取肝脏。实验过程中无小鼠死亡。

1.2.2 血清谷丙转氨酶(ALT)活性的检测：使用全自动生化分析仪检测血清中ALT的活性。

1.2.3 HE染色切片观察[9]：取小鼠肝脏于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋；切片后，将组织切片脱蜡脱水，经常规HE染色后光学显微镜下观察病理学变化。

1.2.4 肝损伤评分：肝脏HE染色评分标准：脂肪变性：<5%(0分)、5%～33%(1分)、33%～67%(2分)、>67%(3分)；小叶炎症：无病灶(0分)、<2个病灶/视野(1分)、2～4个病灶/视野(2分)、>4个病灶/视野(3分)；气泡样变：无(0分)、少见(1分)、多见(2分)。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测肝组织Gp96的表达量：提取肝脏并用BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)进行蛋白定量，取50 μg样品，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，硝酸纤维素膜(NC膜)转膜，质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h，一抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗(1∶500)37 ℃孵育1 h，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色。β-actin作为内参，Gel Pro 4.0软件分析目的蛋白条带并计算相对灰度值，实验重复3次。

2 结果

2.1 血清ALT活性动态变化小鼠酒精灌胃后，ALT的活性逐渐升高(P<0.05)，18 h后达到最高峰(P<0.01)，之后逐渐降低，24 h接近正常水平(见图1)。

注：与0时正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 HE染色HE染色镜下观察：正常组肝细胞形态完整，肝小叶结构清晰，肝索排列均匀，围绕中央静脉呈条索状；实验组酒精灌胃6 h，肝索紊乱，细胞间隙增大；酒精灌胃12 h，肝小叶结构不清，细胞出现水肿，甚至坏死，部分区域炎症细胞浸润；酒精灌胃18 h，围绕中央静脉周围出现大量的炎症细胞浸润，细胞胞质和胞核间出现间隙，坏死明显；酒精灌胃24 h，组织损伤明显减轻(见图2～3)。

2.3 蛋白免疫印记检测小鼠肝组织中Gp96表达变化酒精灌胃后6 h，小鼠肝组织Gp96蛋白的表达量开始升高，随着时间延长，Gp96蛋白的表达量持续升高，18 h达最高值(P<0.01)，之后开始下降，24 h趋于正常，但仍高于正常水平(见图4)。

注：A：正常组；B：酒精灌胃6 h；C：酒精灌胃12 h；D：酒精灌胃18 h；E：酒精灌胃24 h。

图2 不同时段小鼠酒精性肝损伤中苏木素-伊红染色(HE)结果(放大200倍)

Fig 2 Results of Hematoxylin-eosin staining (HE) in mice withalcoholic liver injury at differenttime points

注：与0时正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

注：A：蛋白免疫印迹；B：蛋白免疫印迹定量分析。 与0时正常小鼠相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

酒精性肝损伤的发病原因单一，主要为大量的酒精摄入所致，但发病机制比较复杂，目前尚未完全清楚。其发病机制主要与氧化应激、炎症细胞因子、乙醛对肝脏的毒性、肠道内毒素、遗传多态性等因素相关[10]。其中最关键的损伤机制为氧化应激和氧自由基产生过多，从而造成脂质大量过氧化，肝细胞出现水肿、凋亡及坏死[11]。HSP90是一类相对分子质量约为90 kD的热休克蛋白，主要定位于内质网，也可从内质网逃逸出并到达细胞膜[12]。正常生理条件下，Gp96具有分子伴侣功能，促进分泌性蛋白或膜蛋白正确折叠；结合折叠蛋白中间体，帮助蛋白组装、胞内定位及蛋白分泌、跨膜运输。同时调节内质网相关降解机器(the ER-associated degradation machinery)降解错误折叠蛋白[13]。研究发现，Gp96介导机体天然免疫应答及特异性免疫应答，可以结合抗原肽，加工提呈肿瘤抗原，维持细胞内环境稳定，对细胞的生长、发育、分化及死亡都具有一定的调节作用，且从肿瘤中分离出来的Gp96-肽复合物可以作为一种有效的疫苗发挥抗肿瘤作用[14-15]。

本研究通过模拟人们豪饮的饮酒方式，构建小鼠急性酒精性肝损伤模型，通过血清ALT检测与组织HE染色结果，观察不同时间点小鼠酒精性肝损伤的动态变化。在此过程中，随着时间推移，肝脏损伤逐渐加重，Gp96也出现了逐级增高。在18 h肝损伤最严重时，Gp96的表达量也达到峰值，24 h有所降低，与此同时肝损伤也开始明显减轻。推测Gp96很可能在肝损伤和修复过程中起着重要作用。小鼠酒精灌胃后18 h内，肝细胞损伤逐渐加重，Gp96表达量逐级升高并达到峰值，机体出现了明显的应激反应。Gp96高表达发挥分子伴侣功能保持细胞蛋白构象稳定，并与细胞内的其他肽类蛋白质结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，最终阻止或减少细胞凋亡发生；应激条件下，其作为应激蛋白在细胞损伤时可以保持细胞内环境的稳定，保护细胞免受细胞毒性效应和应激的损伤[12]。大量研究已证实，氧化应激与脂质过氧化在酒精性肝病的发生、发展中起着十分重要的作用。当大量饮酒后，乙醇及其代谢产物导致肝细胞损伤，肝脏枯否细胞活化，诱导CYP2E1的表达，并使其分泌以TNF-α增加为主的各种细胞因子，促进活性氧(ROS)产生增加，造成氧化应激；ROS作为第二信使活化NF-κB，从而发挥其对基因转录的调控作用。又有文献报道，NF-κB可以通过与Gp96启动子结合，激活Gp96转录，从而上调Gp96表达，促进肝细胞增殖，抑制凋亡，促进细胞周期从静息期向分裂期的转化[16]。因此，随着酒精性肝损伤的加重，Gp96显著升高，可能与其抗凋亡和促进细胞增殖的作用相关。因此，随着酒精性肝损伤的加重，Gp96显著升高，可能与其抗凋亡和促进细胞增殖的作用相关。

综上所述，急性酒精性肝损伤过程中，随着肝细胞损伤的逐渐加重，Gp96表达量不断升高，当表达量到达峰值后，肝细胞损伤有所减轻，提示Gp96具有促进肝损伤后修复的重要作用。但Gp96在急性酒精性肝伤中的具体作用机制目前尚不清楚，今后的研究中将做进一步研究。