沙培林联合SOX9基因siRNA对胃癌细胞生长抑制的机制研究

李 响，赵 彤，吴 忠，刘 莹，王若雨

大连大学附属中山医院肿瘤二科，辽宁 大连 116001

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，进展快、生存期短，预后较差，且近些年的发病率呈上升趋势，给患者的生命健康造成严重威胁[1]。因此，寻找有效的诊疗途径具有重要意义。沙培林(Sapylin)是一种由人源A组溶血性链球菌培养增殖后经青霉素处理后的冻干制剂，目前国内外对于沙培林直接作用于肿瘤细胞研究较少，有研究[2]显示，沙培林可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。SOX9属于SRY相关基因家族，有研究证实，SOX9参与多种肿瘤发生、发展，如胃癌、大肠癌、前列腺癌等[3-4]。胃癌中SOX9表达明显升高，沉默其表达可抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移能力[5]。SOX9表达抑制对胃癌细胞凋亡的影响及机制尚未明确。因此，本研究旨在探讨沙培林或SOX9 siRNA单独及联合对胃癌细胞活力、凋亡的影响及机制，以期为胃癌的诊疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器人胃癌BGC803细胞购自美国ATCC。RPMI 1640培养基、FBS、胰酶均购自美国Gibco；MTT溶液购自美国Sigma；SOX9、β-catenin、cyclinD1和Bax一抗及HRP标记的二抗均购自美国Santa Cruze；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基；流式细胞仪购自美国BD；酶标仪购自美国Bio-Rad。

1.2 细胞培养及siRNA转染BGC803细胞用质量浓度为100 g/L FBS的RPMI 1640培养基，于体积分数为5%的CO2、饱和湿度、37 ℃恒温培养箱中培养。每天观察细胞的生长状态，3 d换液一次，细胞为80%左右生长密度时，用胰酶消化细胞，依据实验需求传代。取生长至对数期的细胞，每孔2 ml(1×105ml-1)接种于6孔板，细胞为60%～70%生长融合度时，参照LipofectamineTM2000转染条件和方法将设计合成的SOX9的特异性siRNA(siSOX9组)及阴性对照siRNA(NC组)转染BGC803细胞，转染浓度为100 nmol/L，同时设置仅加入等体积脂质体为空白对照组，于体积分数为5%的CO2、37 ℃恒温培养箱内常规孵育4～6 h，更换为完全培养基。于转染的48 h收集细胞用于实验研究。

1.3 细胞活力检测实验分组：空白对照组(细胞不经特殊处理)、沙培林组(用0.5 KE/ml的沙培林处理细胞48 h)、siSOX9组(转染SOX9的特异性siRNA 48 h)和沙培林+siSOX9组(用0.5 KE/ml的沙培林和siSOX9处理细胞48 h)。以每孔5×103个细胞接种生长至对数期的BGC803细胞于96孔板，每孔100 μl，于培养箱内常规培养24 h，按照上述分组处理细胞，每组设置5个复孔，收集培养至规定时间的4组细胞，每孔加入10 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，混匀，37 ℃培养箱内孵育4 h，吸弃培养孔内上清，每孔中加入DMSO溶液150 μl，室温轻轻震荡10 min，酶标仪测定吸光度值(A值，490 nm)。实验重复3次。

1.4 细胞凋亡率检测取生长状态良好，达70%～80%生长融合的实验细胞，胰酶消化细胞，以1×106ml-1浓度接种至96孔板，常规培养24 h，按照上述分组处理细胞，收集处理至规定时间的4组细胞，预冷PBS洗涤细胞，500 μl的1×Binding buffer悬浮细胞，分别加入5 μl的Annexin V-FITC和PI，混匀，于室温避光条件反应20 min，再加入300 μl的1×Binding buffer，1 h内流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.5 Western blotting收集各组细胞，适量细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取总蛋白与上样缓冲液混匀，100 ℃变性5 min，取变性蛋白30 μg，每孔道等量，经10% SDS-PAGE分离蛋白，蛋白分离后电转印蛋白至PVDF膜，转好的膜用质量浓度为50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，加一抗，即均按照1∶500稀释的SOX9、β-catenin、cyclinD1和Bax抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜，加HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL显色，X胶片曝光，拍照。以GAPDH为内参，Quantity软件分析蛋白条带的灰度值。实验重复3次。

2 结果

2.1 SOX9基因沉默效果Western blotting检测siRNA沉默BGC803细胞SOX9表达结果显示，siSOX9组SOX9蛋白表达显著低于空白对照组(P<0.05)，而NC组SOX9表达与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图1、表1)。

图1 SOX9 siRNA转染BGC803细胞效果Fig 1 The effect of SOX9 siRNA transfected into BGC803 cells

组别SOX9蛋白相对表达量空白对照组0.447±0.046NC组0.478±0.048siSOX9组0.103±0.012∗F值85.426P值0.000

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

2.2 沙培林或siSOX9抑制BGC803细胞活力MTT检测的各组细胞活力结果显示，沙培林及siSOX9均可抑制BGC803细胞活力，与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，而沙培林+siSOX9组对BGC803细胞活力抑制作用更明显，且与沙培林组及siSOX9组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 MTT检测沙培林或siSOX9对BGC803细胞活力的 影响Tab 2 The effect of Sapylin or siSOX9 on cell viability of BGC803 detected by

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与沙培林+siSOX9组比较，#P<0.05。

2.3 沙培林或siSOX9诱导BGC803细胞凋亡流式细胞术检测的各组细胞凋亡率结果显示，沙培林组和siSOX9组细胞凋亡率均显著高于空白对照组，而沙培林+siSOX9组细胞凋亡率显著高于沙培林组和siSOX9组(P<0.05)(见图2、表3)。

图2 流式细胞术检测沙培林或siSOX9对BGC803细胞凋亡率的影响Fig 2 The effect of Sapylin or siSOX9 on cell apoptosis rate of BGC803 detected by Flow cytometry

表3 流式细胞术检测沙培林或siSOX9对BGC803细胞凋亡 率的影响Tab 3 The effect of Sapylin or siSOX9 on cell apoptosis rate of BGC803 detected by Flow cytometry

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与沙培林+siSOX9组比较，#P<0.05。

2.4 沙培林或siSOX9下调BGC803细胞Wnt/β-catenin信号通路Western blotting检测Wnt/β-catenin信号关键分子β-catenin及下游相关的cyclinD1和Bax的蛋白表达，结果显示，沙培林组和siSOX9组β-catenin和cyclinD1的蛋白表达均显著低于空白对照组，Bax蛋白表达显著高于空白对照组(P<0.05)，而沙培林+siSOX9组细胞β-catenin和cyclinD1的蛋白表达均显著低于沙培林组和siSOX9组，Bax蛋白表达显著高于沙培林组和siSOX9组(P<0.05)(见图3、表4)。

图3 Western blotting检测沙培林或siSOX9对BGC803细胞Wnt/β-catenin信号相关蛋白表达影响

Fig 3 The effect of Sapylin or siSOX9 on expressions of Wnt/β-catenin related proteins of BGC803 detected by Westernblotting

表4 β-catenin、cyclinD1和Bax的蛋白相对表达量Tab 4 The relative expressions of β-catenin, cyclinD1 and Bax proteins

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与沙培林+siSOX9组比较，#P<0.05。

3 讨论

沙培林作为一种抗肿瘤免疫调节剂，近年在临床上广泛应用于腹水、癌性胸的治疗中，且经证实有确切疗效[6]。此外，有临床试验也表明，沙培林可作为多种实体肿瘤的化疗辅助用药[7]。但沙培林直接作用于肿瘤细胞的研究较少。研究[8]表明，沙培林局部应用治疗脑胶质瘤，可通过对多种基因的调控，抑制肿瘤的生长和促进瘤细胞的凋亡。沙培林可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[2]。肿瘤发生、发展是一个多基因、多因素、多阶段的复杂过程，涉及到抑癌基因失活、癌基因激活等，且肿瘤的分子靶向治疗已成为目前的研究热点。如沙培林结合分子靶向可进一步提高胃癌治疗效果，这将给胃癌患者带来福音。

SOX9位于17q24.3-q25.1，是SOX基因家族E亚族中的一员，是一种核转录因子，参与细胞生长、分化、凋亡及肿瘤细胞浸润转移等多种生理及病理过程，在肿瘤发生、发展中有重要作用。但其与癌症间的关系并不明确，如在肺癌、胰腺癌等肿瘤中表达异常增加，发挥癌基因样作用[9-10]，而在宫颈癌和黑色素瘤中表达异常降低，充当抑癌基因样作用[11-12]。这提示对于一些肿瘤SOX9有望成为有效的诊疗靶点。胃癌中SOX9的研究较少，有研究证实，胃癌中SOX9表达升高，沉默其表达可抑制细胞增殖、侵袭和迁移能力[5]。由于RNA干扰(RNAi)技术是一种可在转录后阻断基因表达的新技术，能高效、特异性地抑制基因表达，且在基因功能研究、肿瘤治疗等方面有广泛的应用[13]。因此，本研究使用RNAi技术抑制SOX9表达，以研究其对胃癌细胞的影响。

本研究结果显示，沙培林及SOX9 siRNA均可抑制胃癌BGC803细胞活力，诱导细胞凋亡，联合使用对细胞活力抑制及凋亡促进作用更明显。这提示沙培林和SOX9 siRNA可能产生叠加作用用于胃癌治疗。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路的一个分支，在进化上高度保守，是一个多作用位点、多环节的生长发育调控信号通路，其异常激活影响结直肠癌、胃癌等多种肿瘤的发生、发展[14-15]。β-catenin不仅是一种细胞骨架蛋白，而且是Wnt/β-catenin信号通路的关键调节因子，细胞质内β-catenin积聚到一定程度，可激活Wnt/β-catenin信号下游靶基因表达。目前已发现Wnt/β-catenin信号下游有细胞周期相关蛋白cyclinD1、促凋亡蛋白Bax、c-myc等20多种靶基因，其产物可影响肿瘤发生、发展、预后等[16]。也有研究指出，抑制Wnt/β-catenin信号可降低胃癌细胞生长[17]。本研究结果显示，沙培林及SOX9 siRNA均可下调β-catenin和cyclinD1表达，上调Bax表达，联合对β-catenin、cyclinD1和Bax表达影响更明显。

综上所述，沙培林或SOX9 siRNA均可抑制胃癌细胞活力，诱导细胞凋亡，合用对细胞影响更明显，机制可能与Wnt/β-catenin信号下调有关。本研究提示沙培林或SOX9 siRNA联合可能是胃癌治疗的一个新的途径，但还需更多试验研究及临床试验证实。