深海三文鱼蛋白（肽）抗疲劳作用的实验研究

中国中医科学院医学实验中心（100700）董陈颍 李雪丽 安婉丽 邸莎 孔冉 杨鸿

荣成鸿德海洋生物科技有限公司（264300）周伟

三文鱼，又名鲑鱼，学名鲑科（Salmonidae），属于动物界，脊索动物门，辐鳍鱼纲，新鳍亚纲，真骨下纲，原棘鳍总目，鲑形目，鲑科。共有300多个属种，比较有代表性的鲑鱼有大西洋鲑鱼、太平洋鲑鱼、大马哈鱼等。主要分布在太平洋北部及欧洲、亚洲、美洲的北部地区。其营养成分丰富，具有预防心血管疾病、补充人体矿物质营养及美容养颜等功效[1]，有很高的食用价值，是世界著名的经济鱼类之一。疲劳通常是由于过度活动并且缺乏休息所致的人体自然反应，大致可分为精神上和肉体上。有文献报道，补充氨基酸可以直接用做细胞燃料，维持大脑的正常的兴奋性，恢复机体代谢掉的蛋白质，有利于延缓中枢疲劳的出现及促进体力的恢复[2]。研究报道三文鱼蛋白质含量较高，且必需氨基酸种类齐全、比例适宜，有利于人体对其蛋白质（肽）的吸收[3]。笔者推测将三文鱼进行提取加工制成三文鱼蛋白（肽）粉，可以有效的补充人体氨基酸，从而提高机体对疲劳的耐受。但查阅相关文献，目前未见有关三文鱼抗疲劳的研究。为此，我们分析了三文鱼蛋白（肽）的氨基酸成分，进行了小鼠负重游泳时间、小鼠游泳后血清尿素氮（BUN）、肝糖原含量测定，以此来评价深海三文鱼蛋白（肽）的抗疲劳作用。研究报道如下。

1 实验材料

受试样品及药品、仪器：①深海三文鱼蛋白（肽），淡黄色粉末，由荣成鸿德海洋生物科技有限公司提供，批号：20150202，规格：400g/袋。②尿素氮(BUN)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：2015050；③小鼠肝糖原elisa试剂盒，上海江莱生物科技有限公司，批号：201505；④PBS缓冲液，Beijing Sdarbio Science &Technology Co.,Ltd，批号：20141204；⑤多功能酶标仪，BioTek Instrument，Inc 产品；⑥德国SYKAM全自动氨基酸分析仪S-433D。

附表1 深海三文鱼蛋白（肽）抗疲劳实验小鼠体重变化（x±SD）

附表2 深海三文鱼蛋白（肽）对小鼠负重游泳时间的影响（x±SD）

附表3 深海三文鱼蛋白（肽）对小鼠血清尿素氮、肝脏肝糖原水平的影响（x±SD）

2 实验方法

2.1 动物实验方法

2.1.1 深海三文鱼蛋白（肽）配制 准确称取原料样品72g、36g、18g，蒸馏水配至200ml，混匀后作为受试药物备用。给药剂量分别为21.6、10.8、5.4g/kg。

2.1.2 运动耐力试验（负重游泳试验） 方法：选健康成年清洁级昆明种雄性小鼠，体重18～20g，饲养于室温21.0～22.0℃，相对湿度（45～49）%RH的屏障环境中。实验动物检疫3天，随机分为正常对照组、深海三文鱼蛋白（肽）大、中、小剂量组（给药剂量分别为21.6、10.8、5.4g/kg）。经口灌胃给予深海三文鱼蛋白（肽）混悬液，连续给予受试物30d。每5天记录各组小鼠体重。于末次给样30min后，距鼠尾端1/3处负小鼠体重5%的铅皮，放入水温为25℃（水温正负0.5℃）、40cm×60cm×36cm的游泳箱中。每一批小鼠下水之前均将水温调至25℃，并将室温恒定在25℃。每只水箱一次放入4只小鼠，分别为正常对照组、深海三文鱼蛋白（肽）大、中、小剂量组各一只。用秒表记录自游泳开始至淹没两次的时间，该时间为小鼠的游泳时间。试验结果用t检验。如果受试物组游泳时间比对照组长，且差异有显著性，则可判断为该受试物可延长小鼠游泳时间。

2.1.3 血清尿素氮及肝糖原的测定 实验动物分组、给药同2.1.2。末次给样30min后，将小鼠置于水温为30℃的游泳箱中不负重游泳90min(每箱一次放入5只，每组各一个游泳箱)，做完一批，间隔10min放入第二批。每次入水前均将水温调至30℃，室温恒定在25℃。运动后休息60min，将眼睛周围擦干净，拔眼球取血约0.5mL，4℃ 3000rpm离心10mim，分离血清-80℃冻存备用。取血后处死小鼠，取肝。将肝置于冰上的平皿内，经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取＜100mg的肝组织放入离心管内，-80℃冻存备用。分别按照血尿素氮（BUN）试剂盒及小鼠肝糖原（Glycogen）elisa试剂盒进行血清中尿素氮测定及肝组织肝糖原的测定。

2.2 深海三文鱼蛋白（肽）氨基酸检测方法 根据国标5009.124，取三文鱼干粉19.3mg，使用6mol/L盐酸进行水解后采用氨基酸自动分析仪测定。

3 实验结果

3.1 动物实验结果

3.1.1 体重变化 连续给予深海三文鱼蛋白（肽）30d，每5天记录各组小鼠体重至实验结束。结果显示给予受试物5天时，深海三文鱼蛋白（肽）大中小剂量组平均体重均高于正常对照组（P<0.05，P<0.01）；给药20天和25天，大、中剂量组体重低于正常对照组（P<0.05，P<0.01）；给药30天，三个剂量组体重均显著低于正常对照组（P<0.01）。试验结果见附表1。

3.1.2 负重游泳时间 由实验结果可知，深海三文鱼蛋白（肽）大、中、小剂量组小鼠的力竭游泳时间均比正常对照组显著增加(P<0.01)，表明深海三文鱼蛋白（肽）具有明显的小鼠力竭游泳的抗疲劳作用。试验结果见附表2。

3.1.3 血清尿素氮、 肝糖原的测定 由附表3可知，深海三文鱼蛋白（肽）大剂量组小鼠在剧烈运动休息后，尿素的产生比对照组有明显的下降(P<0.05)；说明深海三文鱼蛋白（肽）大剂量组具有增强机体对运动负荷耐受能力的功效；深海三文鱼蛋白（肽）各个剂量组的肝糖原比对照组无统计学差异， 说明不具有增加机体糖原储备的功效。

3.2 氨基酸检测结果 本次检测根据国标测定食物中氨基酸的方法，适用于食品中酸水解氨基酸的测定，包括天冬氨酸，苏氨酸，丝氨酸，谷氨酸，脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，赖氨酸和精氨酸共16中氨基酸。根据实验结果测定，深海三文鱼蛋白肽中含有的16种氨基酸的含量所占比例见附表4。总氨基酸含量占深海三文鱼蛋白（肽）的85.6%，其中呈味氨基酸：甘氨酸，谷氨酸，天门冬氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸及酪氨酸含量为43.4%，占全部氨基酸的50%以上。必需氨基酸及半必需氨基酸：赖氨酸，亮氨酸，缬氨酸，苏氨酸，异亮氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，精氨酸及组氨酸含量为51.3%，占全部氨基酸的60%左右。支链氨基酸：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸 含量为11.3%，占全部氨基酸的13%以上。

附表4 深海三文鱼蛋白（肽）氨基酸组成及含量（mg/19.3mg,干重）

4 讨论与结论

疲劳为机体生理过程不能持续其机能在某一特定的水平和/或不能维持预定的运动强度，主要表现为运动耐力的下降，故常采用负重游泳试验对小鼠运动耐力进行考察[4]，从而反映机体的机能水平、抗疲劳能力的大小。动物实验结果表明：深海三文鱼蛋白（肽）大、中、小剂量组可增加小鼠的力竭游泳时间，表明深海三文鱼蛋白（肽）大、中、小剂量组具有明显的抗疲劳作用。

糖、脂肪、蛋白质是机体的三大功能物质。而糖是机体组织能量的重要来源，在机体的运动过程中，首先消耗肌糖原，而随着肌糖原的消耗，机体会分解肝糖原，继续供能，增加肝糖原的储备量，可以为机体提供更多的能量，达到抗疲劳的目的[5]；如果长时间运动，机体可利用的糖耗竭时，蛋白质和氨基酸分解代谢加强，则血尿素氮的含量增加。小鼠身体对负荷的适应性增强，则蛋白质和氨基酸分解减少[6]，因此肝糖原、血尿素氮可以用来反映机体抗疲劳的程度。本实验结果显示：深海三文鱼蛋白（肽）虽然不具有增加机体糖原储备的功效，但是可以减少血尿素的产生量，说明深海三文鱼蛋白（肽）具有增强机体对运动负荷耐受能力的功效。

运动情况下甘氨酸是人体重要能源物质——肌酸的重要原料[7]，甘氨酸预先补充后可部分地阻抑机体补体活性的大幅度下降和T淋巴细胞转化活性的下降，并可对操作能力发挥促进作用，提示甘氨酸在运动情况下可成为特殊的“必需氨基酸”。甘氨酸预先补充4周可显著延长小鼠力竭性游泳的时间[8]。谷氨酸可以通过增加肝糖原和肌糖原的贮备，增加机体耐力；提高CPK活性，促进机体肌酸磷酸的积累与转化为ATP，给机体供能；抑制LDH活性，进而减少乳酸的生成；进而极显著提高小鼠的游泳耐力[9]。天门冬氨酸是草酰乙酸的前体，参与三梭酸循环，草酰乙酸的增加可以提高三梭酸循环的速度，促进糖和脂肪在运动中的有氧代谢能力，防止运动疲劳的产生[10]。天门冬氨酸在机体内可进人肝脏和肾脏参与无氧代谢，经糖异生作用生成葡萄糖或糖原，提高机体内血糖含量，其形成的草酸乙酸也可以在无氧的条件下直接经糖异生转变为葡萄糖或糖原，从而提高血糖浓度和肌糖原储备，提高无氧供能能力[11]。L-精氨酸经人体内三种NOS同工酶催化分解产生内源性NO，内源性NO具有舒张血管，改善循环系统、提高氧利用率的作用。氨在运动时由肌肉产生并释放到血液，血氨浓度升高，在脑中积累，进而影响脑机能，导致中枢神经系统疲劳，降低运动能力。而精氨酸在体内可参与鸟氨酸循环，提高体内精氨酸的含量，使肝脏内鸟氨酸循环速度加快，提高氨的清除速度，防止运动疲劳的产生。研究结果显示L-Arg显著延长负重游泳时间，降低糖无氧酵解引起的乳酸积累，从而产生抗疲劳效果。亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，这三种氨基酸因其分子组成中都有支链而又被称为支链氨基酸(Branched-chain Amino Acids, BCAA)。BCAA可通过抑制血液中色氨酸进入脑部，从而减少5-羟色胺(5-HT)的生成，发挥抗中枢疲劳作用；通过清除过自由基及加速肌肉蛋白质的合成，抑制机体蛋白质的分解，从而减轻外周肌肉组织损伤，加快运动后机体的修复，起到抗外周性疲劳作用；补充BCAA可促进糖的异生作用，减少骨骼肌乳酸的积累，延缓疲劳的发生和促进运动后疲劳的消除。此外，BCAA作为一类特殊参与供能氨基酸，是长时间持续运动时参与供能的重要氨基酸。

通过测定深海三文鱼蛋白（肽）所含氨基酸的种类及含量发现，其含有的甘氨酸，谷氨酸，天门冬氨酸，精氨酸及支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）是有效的抗机体疲劳的氨基酸。其含量约占全部氨基酸的60%左右。而且其必需氨基酸和半必需氨基酸含量丰富，是很好的机体氨基酸补充营养剂。笔者的研究显示深海三文鱼蛋白（肽）具有多种抗疲劳的有效氨基酸，能显著延长小鼠力竭游泳时间，降低血清尿素氮含量，具有明显的抗疲劳作用，是一种很有前景的高质量蛋白质营养补充剂。