CRM1选择性抑制剂KPT-330对急性白血病细胞凋亡的诱导作用及分子机制

韦岩

【摘要】 目的：探讨CRM1选择性抑制剂KPT-330对急性白血病细胞凋亡的诱导作用及分子机制。方法：培养白血病K562细胞株，分为对照组（n=20）与KPT-330处理组（n=40）采用CCK-8实验检测KPT-330对K562细胞增殖的影响，流式细胞仪法测定K562细胞凋亡及细胞周期，Real-time PCR法检测CRM1与Caspase-3 mRNA表达量。结果：在K562细胞中CRM 1呈高表达，KPT-330可呈剂量依赖性地抑制K562细胞增殖且促进细胞凋亡，使G2期细胞减少，subG1期细胞增多，造成细胞周期紊乱。KPT-330可呈剂量依赖性下调CRM1表达，同时上调Caspase-3表达。结论：CRM 1选择性抑制剂KPT-330可以明显促进白血病细胞凋亡，同時抑制其增殖，可能与活化Caspase-3相关。

【关键词】 核转运蛋白; KPT-330; 急性白血病; 细胞增殖; 细胞凋亡; 分子机制

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.22.028 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）22-00-03

急性白血病（acute leukemia，AL）是一种常见的血液系统的恶性肿瘤，是由于造血干细胞异常分化造成患者血液内或骨髓白血病细胞大量增生，影响正常造血功能，浸润至其他组织器官，严重威胁患者的生命健康[1]。AL的具体发病机制尚未十分清楚，可能由多种因素、环节及调控分子参与造成，因此急性白血病的相关分子机制仍是亟待解决的问题[2]。核转运信号蛋白1（chromosome region maintenance 1，CRM1），又称为染色质区域稳定蛋白1，可以参与肿瘤抑制蛋白、生长调控蛋白的核输出[3]。研究发现，CRM1在较多种实体肿瘤及血液系统肿瘤中表达增高，如肺癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、急性髓系白血病等，同时关系到肿瘤患者的预后，因此，CRM1可能成为肿瘤靶向治疗的候选靶点之一[4-5]。KPT-330是CRM1选择性抑制剂中的一种，具有较好的抗肿瘤活性，对于正常细胞的毒性极低，且口服生物利用度较高，但其在急性白血病中的作用机制鲜有研究[6-7]。本文旨在探讨CRM1选择性抑制剂KPT-330对急性白血病细胞凋亡的诱导作用及分子机制，为急性白血病的临床治疗提供更多依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本来源：选取2018年1-12月于笔者所在医院初发未治疗的AL患者40例作为KPT-330处理组，男23例，女17例;年龄16～62岁，平均（40.55±7.89）岁。选择同期的正常造血干细胞提供者20例作为对照组，男12例，女8例;年龄18～64岁，平均（41.23±8.05）岁。

白血病细胞株：购自美国ATCC实验室;RPMI 1640培养基：Gibco-BRL公司;胎牛血清：美国Gibco公司;TransStart First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、TransStart Top Green qPCR SuperMix：全式金生物科技有限公司;DMSO（二甲基亚砜）与Trizol：美国Sigma公司;RIPA裂解液：碧云天生物技术有限公司;KPT-330：Selleck科技有限公司;CCK-8检测试剂盒：同仁化学研究所。细胞周期检测试剂盒：碧云天生物技术有限公司;Annexin V染色试剂盒：美国BD公司;ABI 7500型real time PCR仪：美国Applied Biosystem公司;超净工作台：中国上海博讯实业有限公司;3366型二氧化碳培养箱：美国Forma Scientific公司;ST-16 R型高速离心机：美国Thermo公司;THERMO LABSYSTEM MK3酶标仪：美国Thermo公司;PCRYINWU流式细胞仪：美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人红白血病细胞K562用含10%胎牛血清RPMI 1640培养液，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，每日在显微镜下观察细胞状态，铺满培养瓶约85%时，用胰酶消化传代，取对数生长期细胞用于后续研究。

1.2.2 细胞增殖检测 将K562细胞按每孔1×105的密度接种于96孔板中培养，24 h后分别给予0.2、1.0 μmol/L KPT-330（以DMSO溶解稀释）处理细胞，培养24 h后设立DMSO为正常对照组，每孔中加入10 μl CCK-8试剂，培养于37 ℃继续孵育2～4 h。用仅加入培养基和CCK-8试剂的空白孔调零。应用全自动酶标仪于波长450 nm处测定吸光度值。每组设定6个平行孔，独立重复3次。细胞存活率按公式计算：细胞存活率（%）=A实验/A空白×100%。半抑制浓度（IC50）由对数增殖曲线计算得出。

1.2.3 细胞凋亡检测 分别取对数生长期的三组K562细胞，加入KPT-330（0、0.2、1.0 μmol/L）处理细胞，分别收集培养24、48、72 h的细胞进行检测。具体操作方法参照Annexin V染色试剂盒说明书，每组设定3个平行对照。

1.2.4 细胞周期检测 取对数生长期的K562细胞接种于6孔板，培养24 h后收集细胞，用磷酸缓冲液洗涤细胞，以1 000 r/min离心5 min，乙醇固定后过夜，加入100 μl磷酸缓冲液混匀，在流式细胞仪上进行细胞周期分析。

1.2.5 Real-time PCR法检测CRM 1与Caspase-3表达 用Trizol提取总RNA，取1 ?l提取的总RNA，加入3 ml RNase-free水稀释，分别于260、280、320 nm波长处测定吸光度值。若OD260/OD280比值为1.8～2.2，则表明RNA纯度较高。RNA浓度（?g/?l）=（OD260～OD320）×稀释倍数×0.04。按照TransStart First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书，将RNA反转录成cDNA，于Applied Biosystems仪上进行扩增与检测，保存于-20 ℃。按照TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒说明书要求加入反应体系，控制反应条件，mRNA相对表达量用2-??ct法计算，每个样品设三个平行复孔，引物序列见表1。

1.3 观察指标

观察KPT-330对K562细胞增殖的影响，KPT-330处理组与对照组对K562细胞凋亡率与细胞周期的影响及KPT-330处理组与对照组中CRM 1与Caspase-3 mRNA的表达。

1.4 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，两两比较采用LSD-t检验，多组间比较采用F检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CRM 1在白血病细胞与正常骨髓细胞中表达水平比较

CRM 1 mRNA在K562细胞中表达的相对定量值（relative quantification，RQ）为0.87±0.09，呈较高水平表达。在正常骨髓细胞中表达的相对定量值为0.06±0.02，几乎不表达。K562细胞中CRM1表达水平显著高于正常骨髓细胞，差异有统计学意义（t=39.290 8，P<0.05）。

2.2 KPT-330對K562细胞增殖的影响

KPT-330可呈剂量依赖性地抑制K562细胞增殖，IC50值为0.4 μmol/L，见图1。

2.3 KPT-330处理组与对照组促进K562细胞凋亡比较

分别以0.2 μmol/L与1.0 μmol/L KPT-330处理K562细胞，24、48、72 h后重复测定细胞凋亡3次，与对照组比较，KPT-330可以明显促进K562细胞凋亡，较高浓度的KPT-330细胞凋亡率越高，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.4 KPT-330对K562细胞周期的影响

分别以0.2 μmol/L与1.0 μmol/L KPT-330处理K562细胞24 h后，与DMSO对照组对比，K 562细胞G2期细胞显著减少，subG1期细胞增加，随着KPT-330浓度的增高，K562细胞G2期细胞逐渐减少，细胞周期紊乱显著，见图2。

2.5 KPT-330处理组与对照组中CRM1与Caspase-3 mRNA表达水平比较

KPT-330处理组中CRM1 mRNA表达量较对照组显著下降，Caspase-3 mRNA表达量较对照组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

3 讨论

白血病是因造血干细胞恶性增殖的异质性疾病，病因十分复杂，治疗难度大，预后较差，多发于儿童，易复发，复发后生存率较低，严重威胁患者的生命安全[8]。目前，白血病的主要治疗方法包括化放疗、骨髓移植或靶向治疗等，化放疗给患者带来较多不良反应与并发症，骨髓移植供体来源受限，靶向治疗是将药物与肿瘤细胞特异性结合，对正常细胞的损伤极低，近年来广受青睐[9]。CRM1可以转运含有核输出信号的特异性蛋白出核，在多种肿瘤中均有高表达，选择性CRM1抑制剂可以不可逆性地抑制CRM1与靶蛋白结合，使得肿瘤细胞中的特定蛋白恢复细胞核定位功能，阻止肿瘤抑制因子核输出，从而抑制癌细胞生长[10-11]。在本研究中，CRM1抑制剂KPT-330可呈剂量依赖性地抑制K562细胞增殖，促进细胞凋亡，同时引发细胞周期紊乱，提示KPT-330可以显著抑制白血病细胞增殖，且作用随着药物浓度增高而增强，可能与细胞周期紊乱有关。激活细胞凋亡信号通路是杀灭肿瘤细胞的关键，Caspase在细胞凋亡中起着重要作用，其中Caspase-3是众多凋亡信号通路的关键会聚点，激活后可诱导细胞发生不可逆转的凋亡[12]。在本研究中，KPT-330可呈剂量依赖性上调Caspase-3表达，下调CRM1表达，表明KPT-330可能通过激活Caspase-3从而诱导白血病细胞凋亡。

综上所述，CRM1在急性白血病细胞中呈高表达，选择性抑制剂KPT-330可通过下调CRM1表达，促进Caspase-3活化，从而抑制白血病细胞增殖，促进细胞凋亡，为急性白血病的靶向治疗提供理论依据。

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（收稿日期：2019-03-08） （本文编辑：李盈）