微小RNA-543对大鼠骨关节炎软骨细胞的作用机制研究

罗奋棋　林院　徐杰

【摘要】 目的：研究微小RNA-543對大鼠骨关节炎软骨细胞存在的保护作用机制。方法：此次研究选取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠进行研究，采取随机数字表法将入组的大鼠分成研究组和对照组，每组10只，对照组大鼠不进行特殊处理，研究组大鼠接受关节内侧副韧带切断术，构建建立大鼠骨关节炎（OA）模型，采用PCR检测方法分别检测两组大鼠软骨组织的microRNA-543表达水平。对大鼠正常膝关节软骨细胞进行体外分离，10 ng/L的IL-1β培养24 h形成体外OA模拟状态，使用miR-543 mimics进行转染，观察分析miR-543过表达对IL-1β诱导条件下软骨细胞增殖及凋亡相关基因表达水平的影响。结果：研究组大鼠的软骨组织中miR-543的表达水平显著低于对照组（P<0.05）。miR-543 mimics转染后软骨细胞的增殖率明显高于对照组（P<0.05），经过IL-1β诱导处理的软骨细胞增殖能力显著低于对照组（P<0.05），经过miR-543 mimics转染后IL-1β诱导处理过的软骨细胞增殖能力显著上升（P<0.05）。miR-543 mimics转染细胞MDM4 mRNA表达水平明显低于对照组（P<0.05），Akt1和Bcl-2 mRNA的表达显著高于对照组（P<0.05），经过IL-1β诱导处理后的软骨细胞MDM4 mRNA表达显著高于对照组（P<0.05），Akt1和Bcl-2 mRNA表达则显著低于对照组（P<0.05），经过miR-543 mimics转染后，IL-1β诱导处理过的软骨细胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表达水平的变化能够得到显著缓解（P<0.05）。结论：OA大鼠的软骨组织miR-543表达会显著下降，通过miR-543 mimics转染促进miR-543表达上调，能够使软骨细胞的增殖得到提升，加之对MDM4、Akt1、Bcl-2表达的影响，能够有效对抗IL-1β诱导引发的软骨细胞损伤。

【关键词】 微小RNA-543; 骨关节炎; 软骨细胞; 作用机制; 细胞凋亡

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.24.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）24-000-03

【Abstract】 Objective：To study the protective mechanism of microRNA-543 on the presence of chondrocytes in rat osteoarthritis.Method：In this study，20 healthy SD（Sprague-Dawley） rats were randomly divided into study group（n=10） and control group（n=10）.The rats in the study group were treated without special treatment.The rats in the study group underwent medial collateral ligament cutting，and the model of osteoarthritis（OA） was established.The expression of microRNA-543 in cartilage tissue of the two groups was detected by PCR.Rat normal knee cartilage cells were isolated in vitro and cultured with 10 ng/L IL-1β for 24 h to form OA simulation in vitro.The effect of miR-543 overexpression on the proliferation of chondrocytes and the expression level of apoptosis-related genes under the induction of IL-1 under the induction of IL-1 was observed.Result：The expression level of miR-543 in cartilage tissue of the study group was significantly lower than that of the control group（P<0.05）.The proliferation rate of cartilage cells induced by miR-543 mimics was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.The proliferation ability of cartilage cells induced by IL-1β was significantly lower than that of the control group（P<0.05）.The proliferation ability of treated cartilage cells induced by IL-1β was significantly increased after miR-543 mimics transfection（P<0.05）.The expression of MDM4 mRNA in miR-543 mimics transfected cells was significantly lower than that in the control group（P<0.05）.The expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.The expression of MDM4 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly higher than that in the control group（P<0.05），and the expression of Akt1 and Bcl-2 mRNA.The expression of MDM4，Akt1 and Bcl-2 mRNA in chondrocytes induced by IL-1β was significantly relieved after transfection with miR-543 mimics（P<0.05）.Conclusion：The expression of miR-543 in cartilage tissue of OA rats is significantly decreased.The expression of miR-543 is up-regulated by miR-543 mimics transfection，which can enhance the proliferation of chondrocytes and the expression of MDM4，Aktl and Bcl-2.The effect is effective against the chondrocyte damage induced by IL-1β.

【Key words】 MicroRNA-543; Osteoarthritis; Chondrocytes; Mechanism of action; Apoptosis

First-authors address：Fujian Medical University Provincial Clinical College，Fuzhou 350001，China

骨关节炎属于关节边缘处的退行性病变，其发生和发展与年龄、体重、外部创伤、劳损及先天性异常等因素，具有密切关系，是多样因素引发的关节软骨退化损伤、关节边缘及软骨下骨反应性增生[1-2]。骨关节炎在老年患者中具有较高的发病率，属于常见的慢性疾病，患者会出现缓慢发展的关节疼痛、压痛及僵硬、肿胀和活动受限等症状，对患者的生活质量会产生严重影响[3-4]。骨关节炎的发病机制较为复杂，研究分析认为软骨细胞的异常迁移和增殖，引发关节软骨的修复功能异常，可能是导致疾病发生的主要原因，也是临床治疗中最主要的靶标[5-6]。微小RNA作为内源性非编码小RNA，能够翻译抑制或切割靶基因RNA，进而使蛋白质的表达水平下降，对细胞增殖与凋亡形成调控作用[7-8]。既往研究中对miR-543在骨肉瘤肿瘤细胞等方面的作用进行了分析，但对于其在骨关节炎中的作用机制尚未进行研究，相关作用机制尚不明确[9-11]。此次研究选取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠进行研究，对比分析正常大鼠和关节炎大鼠的microRNA-543表达水平，并通过体外分离和IL-1β诱导，分析miR-543过表达对骨关节炎大鼠软骨细胞增殖及凋亡相关基因及炎症因子表达的影响，进一步研究和明确微小RNA-543对大鼠骨关节炎软骨细胞的保护作用机制，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

此次研究选取20只健康SD（Sprague-Dawley）大鼠（济南金丰实验动物有限公司）进行研究，入组后大鼠均使用常规饲料喂养，体重范围是320～350 g，平均体重（328.46±5.26）g，采取随机数字表法将入组的大鼠分成研究组和对照组，每组10只，对照组大鼠不进行特殊处理，研究组大鼠接受关节内侧副韧带切断术，建立大鼠骨关节炎（OA）模型，使用0.5%的水合氯醛经腹腔注射麻醉，使用剂量为0.35 g/100 g。在完成手术，两组大鼠均连续3 d肌肉注射青霉素，使用剂量是2×104 U/kg。在1周后，驱赶两组大鼠进行跑步运动，30 mim/d。入组大鼠的选取和应用均符合美国国家卫生研究院实验动物护理和使用指南要求。

1.2 实验方法

软骨细胞的原代培养和miR-543 mimics转染方法：在无菌环境下，摘取正常大鼠的双侧膝关节软骨，切下一部分组织进行RNA提取，剩余部分放到含双抗的磷酸盐缓冲液中进行清洗，300 g离心处理10 min后，去除上清，使用20%FBS DEME-F12培养液进行培养，温度37 ℃，湿度适度，空气环境5%CO2。在实施转染的前1 d，以2×105/cm2的密度，把待转染细胞接种到12孔板上，当细胞融合率达到60%～80%时，按照转染试剂盒的说明要求实施miR-543 mimics转染，并进行相应的阴性对照，在验证转染效率之后实施后续实验步骤。

软骨细胞增殖能力检测方法：制取对数生长期的软骨细胞，于96孔板中进行接种，每孔的接种细胞数量是5 000个，每组设置6个复孔，并设立无细胞空白对照组。在软骨细胞miR-543 mimics转染之后，10 ng/L的IL-1β培养24 h，每孔当中加入5 μg/ml的MTT溶液20 μl，在孵育4 h后，去除上清，每孔加200 μl的DMSO，振荡处理10 min之后，使用酶标仪读取光密度值，重复三次读取。

细胞凋亡相关基因和炎症因子的检测方法：使用PCR方法检测，在6孔板中培养原代软骨细胞，miR-543 mimics不转染和转染48 h条件下，10 ng/L的IL-1β培养24 h，使用TRIzo1试剂盒提取细胞总RNA，再反转录合成cDNA之后实施PCR检测，观察基因表达水平，按照说明书要求操作。反应的条件是90 ℃环境下3 min。

1.3 统计学处理

使用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组别软骨组织及细胞中的miR-543表达水平对比

研究发现，对照组大鼠和对照细胞的miR-543相对表达水平是1.00，研究组的表达水平是（0.62±0.16），经过IL-1β诱导处理组的水平是（0.74±0.17），研究组大鼠的软骨组织中miR-543的表达水平显著低于对照组（P=0.012），经过IL-1β诱导处理的软骨细胞miR-543的表达水平显著低于未进行诱导处理的软骨细胞（P=0.024），见图1。

2.2 miR-543表达水平上调对骨关节炎软骨细胞增殖能力的影响

研究发现，对照组骨关节炎软骨细胞相对存活情况是（1.00±0.18），经过IL-1β诱导处理组是（0.51±0.14），miR-543 mimics转染组是（1.29±0.12），经过miR-543 mimics转染后IL-1β诱导处理过的软骨细胞相对存活情况是（0.89±0.19），miR-543 mimics转染后软骨细胞的增殖率明显高于对照组（P=0.024），經过IL-1β诱导处理的软骨细胞增殖能力显著低于对照组（P=0.027），经过miR-543 mimics转染后IL-1β诱导处理过的软骨细胞增殖能力显著上升（P=0.035），miR-543 mimics转染能够逆转IL-1β对细胞增殖作用的抑制效果，见图2。

2.3 miR-543表达水平上调对骨关节炎软骨细胞凋亡相关基因表达的影响分析

研究发现，对照组的MDM4、Akt1和Bcl-2相对表达水平均是1.00，经过IL-1β诱导处理组的MDM4、Akt1和Bcl-2相对表达水平分别是（1.47±0.29）、（0.64±0.18）和（0.49±0.12），miR-543 mimics转染组的MDM4、Akt1和Bcl-2相对表达水平分别是（0.46±0.17）、（1.42±0.24）和（1.51±0.18），经过miR-543 mimics转染后IL-1β诱导处理组的MDM4、Akt1和Bcl-2相对表达水平分别是（0.97±0.12）、（0.87±0.19）和（0.82±0.11）。miR-543 mimics转染细胞MDM4 mRNA表达水平明显低于对照组（P=0.028），Akt1和Bcl-2 mRNA的表达显著高于对照组（P=0.024，0.260），经过IL-1β诱导处理后的软骨细胞MDM4 mRNA表达显著高于对照组（P=0.030），Akt1和Bcl-2 mRNA表达则显著低于对照组（P=0.028、0.027），经过miR-543 mimics转染后，IL-1β诱导处理过的软骨细胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表达水平的变化能够得到显著缓解（P=0.022、0.024、0.027），见图3。

3 讨论

此次研究中，通过大鼠OA模型的构建进行研究，研究结果表明，研究组大鼠的软骨组织中miR-543的表达水平显著低于对照组（P<0.05），经过IL-1β诱导处理的软骨细胞miR-543的表达水平显著低于未进行诱导处理的软骨细胞（P<0.05）;miR-543 mimics转染后软骨细胞的增殖率明顯高于对照组，经过IL-1β诱导处理的软骨细胞增殖能力显著低于对照组（P<0.05），经过miR-543 mimics转染后IL-1β诱导处理过的软骨细胞增殖能力显著上升（P<0.05），miR-543 mimics转染能够逆转IL-1β对细胞增殖作用的抑制效果;miR-543 mimics转染细胞MDM4 mRNA表达水平明显低于对照组，Akt1和Bcl-2 mRNA的表达显著高于对照组（P<0.05），经过IL-1β诱导处理后的软骨细胞MDM4 mRNA表达显著高于对照组，Akt1和Bcl-2 mRNA表达则显著低于对照组（P<0.05），经过miR-543 mimics转染后，IL-1β诱导处理过的软骨细胞MDM4、Akt1和Bcl-2 mRNA表达水平的变化能够得到显著缓解（P<0.05）。研究结果表明，miR-543表达可能属于骨关节炎分子生物学的病因，通过miR-543表达水平的监测，能够为骨关节炎疾病的发生发展情况提供依据，同时外源性的miR-543补充能够在骨关节炎病情控制中发挥积极作用。

骨关节炎疾病发展过程中，软骨细胞异常凋亡属于主要作用机制之一，MDM4能够定位在凋亡的关键细胞器线粒体上，将TP53线粒体的凋亡途径激活，同时还能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，增加细胞色素C释放，进而产生促进细胞凋亡的效果;至于Akt1能够对mTOR信号通路进行调控，从而减缓细胞凋亡。miR-543表达水平上调后，MDM4表达下降，而Akt1、Bcl-2表达上升，在IL-1β诱导作用后，miR-543表达能够使MDM4释放受到抑制，提升Akt1、Bcl-2表达水平[12-13]。在骨关节炎发病当中，炎症因子的过表达和病情严重程度具有密切关系，大量释放炎症因子既会导致软骨细胞损伤，还会使软骨细胞分化及诱导ECM降解的作用受到影响[14-15]。

综上所述，OA大鼠的软骨组织miR-543表达会显著下降，通过miR-543 mimics转染促进miR-543表达上调，能够使软骨细胞的增殖得到提升，加之对MDM4、Akt1、Bcl-2表达的影响，能够有效对抗IL-1β诱导引发的软骨细胞损伤。

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（收稿日期：2019-07-10） （本文編辑：张亮亮）