基于网络药理学技术的中药地榆活性成分及药理作用研究＊

李 娃，杨春娟，成聪聪，张唯佳，彭 昶，袁月梅，姚美村＊＊

（1.中山大学药学院 广州 510000;2.哈尔滨医科大学药学院 哈尔滨 150081；3.沈阳药科大学药学院 沈阳 110016）

地榆（Sanguisorbae Radix）是蔷薇科植物，以干燥根入药，始载于《神农本草经》，性微寒，味苦、涩、酸，归肝和大肠经，有凉血止血、清热解毒、消肿敛疮等功效。现代化学成分研究表明，地榆含有较多的鞣质类成分，包括地榆素、鞣花酸、没食子酸、儿茶素等，还含有其特有成分地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ等。而药理研究表明，地榆有抗炎[1,2]、抗菌[3]、止血、抗氧化[4]、抗肿瘤[5]等药理作用，是临床常用于化疗后升白及治疗痔疮的重要药物。我们在进行地榆相关研究时，发现其具有明显的免疫增强作用[2]，如对结直肠癌细胞增殖具有抑制作用[6]，对Wnt/β-catenin 信号通路有明显的下调作用[7]，以及对结核分枝杆菌和耐药金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用等，这提示地榆具有广泛的、多方面的药理活性。这些研究有助于认识地榆的药效活性，但仍不能深层次的揭示产生这些活性的作用机制。

随着生物科学和信息技术的飞速发展，人们对生命科学的研究已经从单一分子转向多分子之间的相互作用及这种相互作用所构成的复杂网络上，特别是对于多成分、多靶点和多途径的中药来说更是如此。网络药理学作为研究这种复杂作用网络最主要的方法和手段，在中药物质基础和作用机制方面起到了非常重要的作用[8,9]。在网络药理学的分析中，研究者结合多个数据库软件，针对药物成分、靶点、疾病之间的关系进行数据挖掘和整合分析[10]，可直观、高效地展示药物与机体之间的相互作用，并预测产生这种相互作用潜在的规律及机制。“中药网络药理学”促进了中医学中的中药研究从“单一靶标、单一药物”向“网络靶标、多成分药物”模式的转变。同时，一系列中药网络药理学方法得以创建，使中医学从基于经验的医学迈向了基于证据的医学，并加快了中药药物的发现，改进了药物研究策略[11,12]。尤其在中药方剂复杂化学体系与病证复杂生物系统的相互作用研究中提出了“网络靶标”这一新的思路与方法。通过将病证、方药映射于生物分子网络，并在网络上对病证与方药的关系进行机制性计算、分析、预测，来发现药效物质及作用机制，方剂配伍规律等[13]。

本研究将应用网络药理学的方法和手段进行地榆作用机制的探讨。通过数据库搜索出地榆活性成分对应靶点和信号通路，再应用多种数据分析软件，构建成分-靶点-通路的网络模型，分析地榆多种药理活性的潜在机制，并预测其新的活性，为地榆的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 地榆化学成分的收集及靶点预测

以地榆为关键词在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）数据库中进行成分与对应靶点的查询以及筛选，并根据Uniprot 数据库（http://www.uniprot.org/）查询靶点蛋白所对应的基因名称。TCMSP 数据库是针对《中国人民共和国药典》中的每味中药，利用人工在互联网上查询与每味中药相关的已发表文献和书籍，并参考了国内外广泛使用的中药数 据 库，如：TCMDatabase@Taiwan，TCMID，Chem-TCM，TCM-ID，HIT等，获取到了每味中药可靠的成分信息[14]。

1.2 靶点分类富集分析

Biological Networks Gene Ontologutool（BiNGO）分析工具将Gene Ontology（GO）数据库与Cytoscape 软件连接并对基因进行可视化注释分析。将靶点基因导入该数据库，以P<0.05 为显著性阈值，进行GO 生物学过程与分子功能分类富集分析。

1.3 通路富集分析

采用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery（DAVID）数据库，对靶点蛋白进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析，并在KEGG 数据库中对富集通路进行注释和分析。

1.4 地榆传统活性作用机制分析

利用NCBI Gene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索人源的抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、止血相关基因。将各种活性的相关基因与地榆成分对应靶基因进行相互映射，相互映射所得的基因再根据DAVID数据库进行KEGG 通路富集分析，分析地榆传统生物活性的靶点和作用机制。

1.5 地榆成分-靶点-通路可视化网络互作分析

将相应的成分、靶点、通路导入Cytoscape软件，构建成分-靶点，靶点-通路，成分-靶点-通路网络，并进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 地榆主要化学成分

根据TCMSP数据库收集到35个化学成分，包括最常见的没食子酸、儿茶素、鞣花酸等鞣质类成分以及地榆皂苷（表1）。

2.2 潜在靶点预测

通过数据库分析，发现地榆中有20个化学成分涉及到230个靶点蛋白（共339次），出现频次较多的靶点蛋白（表2）。

从结果可知前列腺素G/H 合成酶1（Prostaglandin G/H synthase 1，P23219）、前 列腺 素G/H 合 成 酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，P35354）、热休克蛋白90α（Heat shock protein HSP 90 alpha，P07900）、孕激素受体蛋白（Progesterone receptor，P06401）、细胞核受体共激活剂（Nuclear receptor coactivator 2，Q15596）、磷脂联 脂 醇- 4,5- 二 磷 酸 三 激 酶 催 化 亚 基,γ 异 型（Phosphatidylinositol- 4,5- bisphosphate 3- kinase catalytic subunit,gamma isoform，P48736）等靶点出现的频率较高。

2.3 Gene Ontology分析

GO分析是对基因在生物过程、分子功能等方面分类富集的注释，其中P值的大小体现了蛋白质群与生物学功能的相关程度。地榆化学成分的GO生物过程与分子功能富集显著性前十的分析结果见图1。由结果可知，靶点蛋白参与的生物学过程有RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控、转录过程、细胞增殖过程、炎症过程、血管生成等，表明了地榆中的化学成分参与了体内多种生物学过程。同时，靶点蛋白参与了特异性DNA序列结合、蛋白质二聚体结合作用、血红素结合作用、细胞因子活性、类固醇激素受体作用等分子功能，表明地榆对生物体内的多种分子功能具有一定的影响。

2.4 地榆化学成分潜在靶点通路预测

将230 个靶点输入DAVID 分析软件，进行KEGG通路分析，根据P<0.05 筛选共获得118 条重要通路，利用KEGG数据库对筛选出的通路进行注释分析。结果表明，与人类疾病相关的通路有52条，包括癌症、炎症、内分泌代谢疾病、神经变性疾病、免疫疾病等。与信号传导有关的通路有20条，与免疫系统相关的通路14 条，与内分泌系统相关的通路有10 条，与神经系统相关通路7条，与细胞内生物过程相关通路7条等。其中根据P值大小排名前20的通路结果见表2。在临床研究中，刘纯一等人[15]在地榆升白片联合重组人粒细胞刺激因子治疗癌症相关性乏力研究中发现地榆升白片联合重组人粒细胞集落刺激因子能够改善肿瘤患者在化疗期间的白细胞减少和疲劳症状。程林忠等人[16]也发现地榆升白片加Vit B4能较好的防止放疗引起的骨髓抑制，维持白细胞稳定。王燕玲[17]通过临床观察发现包含地榆的肛瘘愈创洗液对胃肠道慢性炎症肉芽肿性疾病克罗恩病有良好的治疗作用。

表1 地榆中主要化学成分

表2 地榆化学成分的潜在靶点信息

2.5 地榆化学成分-靶点-通路可视化互作网络

应用Cytoscape 软件构建地榆化学成分与靶点蛋白，靶点蛋白与通路网络，20 个化学成分，230 个靶点以及118 条通路之间相互网络关系见图2、图3。由图可见，地榆化学成分与靶点蛋白，靶点蛋白与信号通路存在复杂的网络关系，地榆成分通过不同的靶点蛋白在多个通路中发挥作用。其中，我们以稳定转染了TCF/LEF序列的NIH3T3细胞为模型，利用荧光报告基因系统验证了地榆对根据网络药理学预测出的Wnt通路的影响，发现地榆能够抑制Wnt通路，并对该通路上的关键蛋白β-catenin的表达明显下调，结果见图4。

2.6 地榆传统活性的成分-靶点蛋白-通路网络

将地榆的传统活性抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、止血作用的相关基因与地榆化学成分对应的靶点相映射，得到与抗炎相关的靶点23个，抗菌相关靶点10个，抗氧化相关靶点50个，抗肿瘤相关靶点52个，止血相关靶点9个。再将这些靶点依次输入DAVID软件进行KEGG 分析，根据P<0.05 对通路进行筛选，最后再利用Cytoscape软件构建成分-靶点-通路网络，预测地榆传统活性的潜在机制。以抗肿瘤活性为例其可视化网络图见图5。

3 讨论

本论文应用网络药理学研究方法，对传统中药地榆的活性成分[18]进行了靶点预测和网络构建，探索了地榆的活性成分、靶点蛋白、信号通路3种节点之间的网络特征。从结果可以看出，地榆的20个成分主要通过P23219、P35354、P07900、Q15596、P48736 等蛋白发挥生物作用，说明这些蛋白有可能是地榆成分的主要潜在作用靶点。通过对118 条通路的分析可知，癌症通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路、胰腺癌通路以及HIF-1信号通路是地榆化学成分发挥生物效用的主要信号通路。

图1 地榆成分的GO生物学分析

表3 地榆主要的成分潜在作用通路预测

图2 地榆成分-靶点蛋白网络

图3 地榆成分的靶点蛋白-信号通路网络

图4 地榆对Wnt通路及其关键蛋白的影响

通过地榆传统活性作用成分-靶点蛋白-信号通路网络药理学分析，抗肿瘤、抗氧化作用可能是地榆成分最主要的两个活性，其中抗肿瘤作用涉及到的癌症有前列腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、结直肠癌等。同时，根据网络药理学研究结果可知，凋亡调控因子BAX(Q07812)、凋亡调节因子Bcl-2（P10415）、转录因子AP-1（P05412）、转录因子p65（Q04206）、细胞分裂蛋白激酶2（P24941）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1（P38936）、NF-κB 激酶亚单位α抑制剂(O15111)等靶点蛋白在癌症信号通路中发挥着重要作用，并且地榆中的槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是影响这些靶点的主要成分，这对研究地榆中化学成分抗肿瘤作用的作用靶点及机制探讨具有重要的指导意义。最新研究中，Goun 等人[19]发现地榆能够明显抑制白血病大鼠白细胞的增殖作用。Shin,J.A.等人[20]研究了地榆对人源的口腔癌细胞HSC4、HN22，Mazzio，E. A.和Soliman，K.F.研究了对宫颈癌细胞Hela[21]、Choi,E.S.研究了对前列腺癌细胞PC3[22]均有一定的增殖抑制效果。王志宇等人[23]研究了地榆水提物对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的增殖起到抑制作用，且该抑制作用可能与地榆阻滞细胞周期，促进细胞凋亡等因素密切相关。地榆中的鞣质类成分没食子酸和鞣花酸[23]可能是抗乳腺癌细胞增殖的主要活性成分，皂苷类成分在抗乳腺癌细胞增殖作用上也有一定的效果，其主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡或激活ROS/JNK 通路等多种途径发挥抗乳腺癌作用[24,25]。这些有关地榆对癌细胞研究的报道与我们通过网络药理学分析的结果基本相符。

在抗氧化作用方面，PI3K-Akt signaling pathway、HTLV-I infection、Focal adhesion、Sphingolipid signaling pathway 信号通路的节点度数较高。Wen,H.等[26]发现二苯乙烯类化合物能够通过PI3K-Akt 通路对大鼠皮质神经元起到抗氧化作用。Zhou, X.等[27]研究表明PI3K/Akt依赖性激活Nrf2对大鼠左心室重构发挥抗氧化作用，说明PI3K-Akt 信号通路与抗氧化作用密切相关。且地榆中槲皮素所对应的P31749、P48736、Q04206、P01375、P04637 靶点蛋白节点度数较高可能是发挥抗氧化作用的主要靶点。相关研究报道表明，通过大孔树脂柱分离获得的地榆多酚对羟自由基和DPPH自由基具有较强的抑制作用从而起到抗氧化效果[28]，地榆鞣质能够提高D-型乳糖衰老大鼠的抗氧化能力，其可能与地榆鞣质抑制大鼠体内脂质过氧化物的生成、抗氧化酶活性的提高有关[29]，同时，地榆提取物对加速老化小鼠的氧化应激反应存在影响，能有效减缓小鼠的衰老过程[30]，这些研究结论部分验证了地榆抗氧化作用网络药理学的预测结果。

本研究通过地榆化学成分的潜在靶点预测、通路分析和地榆化学成分-靶点-信号通路网络的构建，揭示了地榆中化学成分在癌症、炎症、内分泌代谢疾病、神经变性疾病、免疫疾病等疾病的治疗具有一定疗效，以期为研究地榆多种药理活性及其作用机制分析提供参考。