HIV/HBV合并感染者HBV核心区与多聚合酶区特异性细胞毒性T细胞表位变异分析

邓西子，聂 源，兰 芸，李 锋，高 鸣，蔡卫平，李凌华，胡凤玉

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的特异性细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)通过识别HBV抗原表位，在清除细胞内感染病毒发挥关键作用。HBV的核心(core,C)区和多聚合酶(polymerase,P)区基因变异导致编码的氨基酸突变，CTL抗原表位的序列或构象发生改变进而引起表位的免疫原性改变，导致宿主抗HBV的免疫应答发生改变。若反应强度不足，病毒难以清除，感染慢性化从而进展为肝硬化、肝癌[1-2]。研究报道，合并人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染造成的免疫缺陷明显加速HBV所致的肝病进程，终末性肝病(包括肝硬化、肝癌、肝衰竭)已成为HIV感染者死亡的首要原因，具体机制不明[3-4]。目前，HIV/HBV合并感染是否影响HBV的C蛋白和P蛋白的特异性CTL表位变异进而与肝病进程加快关联尚缺乏相关报道。本研究拟以直接测序法，对HIV/HBV合并感染者C区和P区的CTL表位变异进行检测分析，并以HBV单一感染者为对照，研究HIV/HBV合并感染者C区和P区的CTL表位变异特征，为深入探讨HIV/HBV合并感染者疾病进展和转归的致病机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2009年1月—2011年12月广州医科大学附属广州市第八人民医院收治的慢性HBV感染者，依据治疗前HIV抗体检测结果分为HIV/HBV合并感染组和HBV单一感染组。所有患者均经过乙肝血清标志物检测且表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阳性>6月确诊HBV感染，所有HIV/HBV合并感染者均经过酶联免疫吸附实验和蛋白质印迹法确诊抗-HIV阳性。获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)和慢性HBV感染的诊断见参考文献[5-6]。成功扩增C区和P区的慢性HBV感染者共151例，其中HIV/HBV合并感染者83例，HBV单一感染68例。2组患者性别组成、年龄、基因型、HBeAg状态、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、HBV载量差异比较均无统计学意义(P值均>0.05)。排除标准：合并有其他肝炎病毒的感染和AIDS相关性的明显的机会性感染；已进行抗病毒治疗；明显的肝硬化、肝衰竭和肝癌等终末性肝病；年龄<18岁、孕妇、哺乳期者；HBV载量<500 U/mL。本研究所采用的样本来自于患者临床常规检测剩余的血清样本，研究经医院伦理委员会审查和批准并获得受试者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV基因扩增 采用QIAamp DNA mini Kit(250)试剂盒(美国罗氏公司)提取血清中的HBV DNA。HBV DNA扩增：PCR第1轮反应：正向引物5′-GTTCATGTCCWACTGTTCAAGCCTCCAAG-3′；反向引物5′-GTTGCATGGTGCTGGTGMRCAGACCAA-3′，扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 200 s(循环30次)；延伸72 ℃ 7 min。PCR第2轮反应：正向引物5′-GGTCTTRCATAAGAGGACTCTTGGACT-3′；反向引物5′-CAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3′，扩增条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 200 s(循环35次)；延伸72 ℃ 7 min。

1.2.2 DNA序列分析 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后送英潍捷基(Invitrogen)公司进行测序,测序方法为Sanger双氧链末端终止法测序。测序引物：片段1：P1(正向)5′-CATCCTGCTGCTATGCCTCA-3′，P2(反向)5′-AGAGGTTCCTTGAGCAGG-3′，P3(正向)5′-CCTATTGATTGGAAAGTATGTC-3′，P4(正向)5′-GACGTCCTTTGTTTACGTCC-3′；片段2：P5(正向)5′-GGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3′，P6(反向)5′-AGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3′，P7(正向)5′-GTGGGTCACCATATTCTTGG-3′，P8(正向)5′-TTGGTGTCTTTTGGAGTGTG-3′。采用ContigExpress软件进行序列整理、拼接，采用Vector NTI软件对基因序列与参考序列进行比对，计数含有表位变异的序列数。参考序列号：B1 D00329；B2 AF121249；B3 M54923；B4 AY033072；B5 AB219429；C1 AY057947；C2 AY217378；C3 X75665；C4 AB048705；C5 AB241111。HBV C区和P区抗原表位见参考文献[7-8]。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，2组患者表位变异率比较采用卡方检验或Fisher精确检验。以P<0.05为差异比较具有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者CTL表位变异差异分析 HBV C区和P区含有10个抗原表位位点，HIV/HBV合并感染组较HBV单一感染组CTL表位变异发生率偏高，其中C18-27、C88-96、C139-148表位变异发生率差异比较具有统计学意义(χ2=7.509，P=0.006;χ2=3.902，P=0.048;χ2=4.238，P=0.040)。基因型对2组患者表位变异发生率无明显影响(数据未给出)。各CTL表位变异率和分析结果见表1。

2.2 2组患者CTL表位变异氨基酸分析 表位的氨基酸变异中，多数只有一个氨基酸替换为其余氨基酸，只有C139-148和P575-583表位出现2个位点氨基酸的替换。C18-27表位主要变异的氨基酸，HBV单一感染组有I27V(4.4%)，而在HIV/HBV合并感染组除I27V(6.0%)变异外，还有新的S26N(4.8%)、S26T(4.8%)变异类型。C88-96、C139-148表位主要变异氨基酸(L95I、T147A)两组患者相同，但显示HIV/HBV合并感染组更高的比例。具体CTL表位氨基酸变异见表2。

表1 2组患者CTL表位变异发生率[n(%)]

注：与HBV单一感染组比较，*P<0.05

表2 2组患者CTL表位变异氨基酸

注：变异的氨基酸以下划线表示。

3 讨论

由于HIV和HBV有相似的传播途径(性接触、血液传播、垂直传播)，HIV感染者常合并HBV感染，我国HIV/AIDS人群中合并HBV感染率为4.2%～19.4%[9]。高效抗逆转录病毒疗法虽可同时抑制患者HIV和HBV复制，延长HIV感染者的预期寿命，但都不能彻底清除HIV病毒库和HBV cccDNA，HBV所致的终末性肝病已成为HIV/AIDS患者死亡的首要原因，但具体机制不明[3-4]。HBV特异性CTL应答是决定宿主能否有效清除细胞内HBV的关键因素，CTL细胞通过识别HBV抗原特异性表位清除病毒，如果表位中氨基酸发生变异，降低与CTL细胞受体的亲和力，可使HBV逃避免疫监视，加快肝病进展[10]。HBV基因组的C区编码的C蛋白和P区编码P蛋白包含多个能被有效识别的抗原表位，我们的研究结果显示，HIV/HBV合并感染组较HBV单一感染组C区和P区的CTL表位变异发生率整体偏高，其中C18-27、C88-96、C139-148 CTL表位变异发生率差异比较具有统计学意义。研究报道，在未经治疗的HIV感染者胃肠道CD4+T淋巴细胞的消耗导致微生物易位增加，引起循环中脂多糖水平升高，脂多糖可结合Toll样受体4并激活核因子-κB等其他通路，导致促炎症细胞因子产生和免疫过度的慢性活化[11-12]。HIV/HBV合并感染及其造成的免疫改变在HBV分子进化中扮演重要的调控作用[13]。本研究发现HIV/HBV合并感染组CTL表位变异率较高可能是病毒逃避宿主免疫压力作用下选择的结果。

HBV的全基因组编码多种病毒蛋白，其中C蛋白的抗原性最强，保守性最好，C蛋白能引起较其他蛋白更强的CTL应答。研究报道，HIV/HBV合并感染者有更高的1762T/1764A突变[14]，同样也有报道在HIV/HBV合并感染者常见-1G缺失突变[15]，然而来自泰国的研究报道，2组C区基因变异无差异[16]，但是这些研究都是基于直接序列分析结果，涉及抗原表位变异的研究甚少。本研究发现HIV/HBV合并感染组C18-27、C88-96、C139-148 CTL表位变异率较HBV单一感染组显著增加。CTL表位变异与病程的进展有明显的相关性，尤其是C18-27表位[17]，此结果可为深入研究合并感染致病机制提供实验依据。变异氨基酸结果显示，HIV/HBV合并感染组的C18-27表位主要变异氨基酸的类型增多，出现独特性S26N(4.8%)、S26T(4.8%)变异，而C88-96、C139-148表位2组患者主要变异氨基酸类型相同。P区表位变异比较中，2组之间无明显差异，其中包括有致拉米夫定耐药的YMDD位点的P551-559(YMDDVVLGA)表位。

综上，本研究通过分析HIV/HBV合并感染组与HBV单一感染组HBV的C区和P区的CTL表位变异差异，发现HIV/HBV合并感染可增加HBV CTL表位变异，尤其是HBV C18-27、C88-96、C139-148表位变异，提示HIV/HBV合并感染者肝病进程加快可能与HBV C区的CTL表位变异增加相关，具体影响机制有待深入研究。