除草剂Atrazine对四膜虫BF5株种群增长的影响

张博霏

摘 要：研究了嗜热四膜虫BF5株 （Tetrahymena thermophila BF5）种群在莠去津（Atrazine）胁迫下的整个变化过程，通过对不同浓度莠去津处理下的种群密度变化，种群自然增长差异，以及种群密度变化的时间差异，对莠去津的相对安全浓度尤其是其对水生原生动物四膜虫的耐受浓度作初步研究。结果表明，在实验条件下50ppb浓度莠去津已使四膜虫种群无法进入对数生长，100ppb浓度使种群受到严重扰动，150ppb以上浓度使种群在48小时内消亡。24小时半致死浓度为64.75ppb，96小时半致死浓度为39.10ppb。

关键词：嗜熱四膜虫BF5株;莠去津;种群密度

随着生活水平的提高，人们对粮食作物和经济作物需求日益增长，在土地自然产力有限，新的高产品种投入产业化生产尚需时日的现状下，增加包括除草剂在内的各种农业化学品的用量和使用频度，成了目前的主要增产方式。然而，在农业产品的增产背后，是相当沉重的生态代价，甚至直接或者间接地威胁到了人类自身的安全和健康。本实验所选取的研究药品——莠去津 （Atrazine） 就是一种长期以来被认为是低毒，甚至是对人类完全安全的除草剂产品，被长期并且广泛地施用。其结果就是这种药物在环境中的普遍存在，在土壤、水体和不少农产品中均存在一定剂量的检出。

1 莠去津（Atrazine）及其相关研究情况

1.1 莠去津介绍

莠去津是继西玛津之后1958年由瑞士嘉基公司开发的三嗪类除草剂，是旱地除草剂主要品种之一，在国内外应用比较广泛。由于莠去津的优良性能及价格优势，目前世界上很多国家普遍应用，是国内大量生产的除草剂品种之一。随着我国除草剂需求量和使用量的增长，国内莠去津原药注册生产企业达到20家以上，年产能超过6万吨，已经成为北方地区使用量最大的除草剂品种之一。

莠去津其他名称有阿特拉津、草脱净、Aatrex，Aktikon，Coyote和Gesaprim等，化学名称为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪。其化学结构式为：

莠去津纯品为白色粉末，由三聚氰酞氯与等当量的乙胺和异丙胺在脱酸剂存在下作用得到。熔点175.80C，相对密度123，微溶于水，稍溶于有机溶剂。在中性、微酸性或微碱性介质中稳定，遇强碱和强酸易分解，土壤中DT 50 100天，水体中代谢时间与许多因素相关。另据USEPA的资料，其在水体中的DT 50 160天左右，温度较低时所需时间更久。

1.2 有关莠去津毒性情况的研究

2003年4月加州大学伯克立分校的Tyrone Hayes等人的研究结果使得人们对莠去津等除草剂的使用安全性再次产生质疑，相对3ppb的莠去津饮用水残留标准，实验中所使用的浓度要相对安全得多。在对非洲爪蛙（ Xenopus laevis ）的蝌蚪进行了试验时，他们把处于发育阶段的蝌蚪放到含有不同浓度的莠去津的水溶液中。当莠去津的浓度达到0.1ppb时，雄性蝌蚪除了长出睾丸外，还长出了卵巢。而当浓度达到1ppb时，雄蛙用来引吭求偶的喉管便无法正常发育，这注定使它们在成年后无法正常求偶。此外，研究人员把雄蛙置于含25ppb的莠去津水溶液中，它们的睾酮水平迅速下降。据此研究人员分析认为，莠去津可能促使芳香族酶产物大量产生，结果把雄激素催化成了雌激素，从而使得雄蛙变成了雌蛙或不雄不雌的“阴阳蛙”。也就是说，对于实验中所涉及的两栖类而言，莠去津可以作为一种环境激素来看待。

1.3 各国对莠去津使用及其残留量的控制标准

鉴于莠去津的潜在的或已部分显露的生态损害，在学界对莠去津的安全性问题存在一定程度的分歧的情况下，美国环保局（USEPA） 于2003年10月31日公布了莠去津临时登记决议。加拿大病虫害防治管理局（PMRA）依据美国环保局的报告建议削减莠去津的用量并于2004年1月1日起生效。欧盟国家则在同一时期或更早时间限制或完全禁止了莠去津的使用。

相对其他国家的控制力度，我国对于莠去津的控制显得较为宽松，根据中国国家标准化管理委员会（SAC） 2005年10月3日发布的G/SPS/N/CHN/88中规定莠去津在苹果和梨中的最大残留限量为200ppb，另在G/SPS/N/CHN/87中规定莠去津在农田灌溉水的限量标准为150ppb。但在最新的生活饮用水国家标准GB 5749-2005中规定莠去津残留应少于2ppb，甚至少于美国的3ppb标准，可见我国已开始关注其潜在的危害性。

2 四膜虫介绍（材料与方法）

隶属于原生动物门、寡膜纲、膜口目、四膜科、四膜虫属。已知有10余种。体长40～60微米，成倒卵形或梨形。口位于腹面前方正中，体表被以纵纤毛带，口后纤毛带一般为2条。胞肛和2个伸缩泡孔均位于细胞后端。无性生殖为横分裂。有性生殖为接合生殖。合子核分裂分化产生新的大小核，两细胞分开、分裂。

世界性分布，主要产自淡水，也有的生活于咸水或温泉中。四膜虫能在无菌的液体培养基中生长繁殖，长期以来用它为材料做了大量营养生长和药物学方面的研究，是真核细胞基因工程研究的理想材料。

2.1 材料

2.1.1 嗜热四膜虫BF5株（ Tetrahymena.thermophila BF5）

嗜热四膜虫BF5株（ T.thermophila BF5）为实验室培养纯化后的四膜虫品系，广泛用于各种实验。实验用四膜虫经实验选用培养液1周以上培养，并保证其在实验所选用培养环境下可正常繁殖后予以使用。

2.1.2 莠去津药液

本次实验所选用的原液为50%莠去津溶液，使用双蒸水稀释至10mg/L与1mg/L两种浓度的实验用液密封保存备用。

2.1.3 四膜虫培养液

实验中可以供选择的培养液和培养基种类很多。主要有如下几种：Singer氏培养液、Elliott氏培养液、（月示）胨培养液、沈锡祺等所用的有机培养液以及实验用四膜虫的原培养液配方，另有固体培养基配方3个。

2.2 方法

2.2.1 相关仪器设备

使用的主要仪器设备如下：

OLYMPUS BH-2型 台式光学显微镜

珠江 LRH-250-G型光照培养箱 广东省医疗器械厂

FA1004型  电子天平 上海天平仪器厂

YXQ602型 电热式蒸汽消毒器 山东新华医疗器械厂

5-50μL、20-200μL、1-5mL移液枪 Therme Electron

200mL三角瓶、10mL及5mL试管、10mL带盖培养管、20及100mL量筒、试管架、各容量烧杯、超净工作台、2mL*24目细胞培养板、100目藻类计数板等

2.2.2 培养液的选择和培养中理化指标的控制

本次实验综合考虑了手头可使用的药品、预实验中四膜虫的生活情况以及培养液的保存情况，最终选用如下培养液作为菌种保存和实验所用培养液。

培养遵循少量——多管独立培养，统一时间转接，正式实验前，菌种在选定培养液中经至少一个完整的种群增长过程。培养温度为26℃±1℃，无光照，PH 7.0左右，每12小时或更短间隔摇匀一次以保证培养液中溶解氧。考虑到四膜虫对氧的需求及较长的培养时间，扩增初期采用10mL试管中加2-3mL培养液的少量多管并列培养的方式，这在一定程度上也可避免在初期种群密度较低时意外混入的杂菌对培养进度的影响。

3 结果与分析

3.1 关于种群的观察数据

于27 ℃恒温培养6小时后开始观察计数，经过约186小时 16次观察计数之后确认实验组种群完全消失，期间数据见附表一。各梯度种群密度变化情况如下图。由于150ppb以上浓度数据量较少，故不单独绘图。

3.2 关于个体差异的观察数据

空白组和50ppb组在前期均存在核交换和结合生殖，空白组更是保持到了稳定期之后仍有核交换，其他各组在实验过程中未发现有性生殖现象。平均个体大小在各组中的差别并不明显，但在同一管内的个体中存在差别，分析为分裂生殖所致。同时，在较高浓度（≥150ppb）的组中以及在趋于衰退的管中，非规则形态的个体以及行动能力低下的個体明显增多。

3.3 来自药物因素的影响分析

其他的实验证明莠去津对呼吸活动主要是线粒体活性有抑制作用，考虑其为药品抑制种群的主要因素。

3.4 来自非药物因素的影响分析

其他因素如温度PH等，特别是pH值和培养液内溶解氧对四膜虫种群的影响也是比较明显的。实验初期发现，在pH值在5以下的培养液中种群难以生长，甚至在短时间内消亡，当pH在6.5-7.5的情况下，四膜虫种群可正常生长。实验周期较长，又无法向管中补充氧气，即使使用容积为10mL的培养管进行5mL以下的培养并间隔一定时间晃动，当种群密度上升到一点数量后，可用肉眼观察到培养液上层接近液面处的密度要大于液体下层，可见其存在一定程度的缺氧。

4 结论

以上的分析和部分推断，对于实验所用的四膜虫菌株，50ppb或以下浓度才是安全的，100ppb是实验所用的四膜虫菌株的耐受极限，超过该值的莠去津浓度会导致种群在48小时左右崩溃。即使莠去津对包括人类在内的温血动物毒性不是相当大，但是作为一种半衰期如此长的化学物质，很难不考虑其慢性毒性和其他不被确定或未知的危害性。相对最新的饮用水标准的2ppb浓度标准，水果（如苹果、梨）中的200ppb，农业灌溉用水的150ppb，乃至粮食作物（如玉米）中的50ppb标准都不算低，从保证食品安全的角度，以及突破农产品贸易中的技术壁垒考虑，都有必要作出更严格的限定。

参考文献：

[1]郭子靖，朴秀英，樊玮，姜辉，王晓军.单嘧磺酯在土壤中的淋溶特性研究[J].农药科学与管理，2011（04）.

[2]张宏军，刘学，沙虎全，张佳，周欣欣.我国除草剂登记使用现状及存在问题[J].杂草科学，2011（01）.

[3]张超，杨红.水、土壤和蔬菜中毒死蜱、甲基毒死蜱残留检测前处理方法[J].农药，2010（05）.

[4]吕品，张岩，李建华，张凤云，陈玉玲.植物细胞活性氧的产生和清除机制[J].生物学教学，2010（02）.

[5]宋倩，梅向东，宁君，袁会珠.除草剂的主要作用靶标及作用机理[J].农药，2008（10）.

[6]Function of the Male-Gamete-Specific Fusion Protein HAP2 in a Seven-Sexed Ciliate[J].Eric S.Cole，Donna Cassidy-Hanley，Jennifer Fricke Pinello，Hong Zeng，Marion Hsueh，Daniel Kolbin，Courtney Ozzello，Thomas Giddings，Mark Winey，Theodore G.Clark.Current Biology，2014（18）.