离子色谱法检测化妆品中L—羟脯氨酸方法研究

孙永泽 杨永超 马晓星

摘 要：建立了一种离子色谱法测定含胶原蛋白类化妆品中L-羟脯氨酸的方法。采用Dionex? AminoPac? PA10 （2×250mm）分析柱，电化学检测器，流动相为水- NaOH溶液-NaAc溶液，梯度洗脱，流速为0.25mL/min，柱温为30℃。结果表明，在5 μg/mL～100 μg/mL范围内，L-羟脯氨酸浓度与峰面积呈良好线性关系，相关系数R为0.9998，检测限和定量限分别为0.15μg/mL和0.5 μg/mL。平均加标回收率为95.8%，RSD为3.4% （n=6）。此方法简便、准确，可用于检测胶原蛋白类化妆品的L-羟脯氨酸含量，为化妆品的常规检测提供技术参考。

关键词：L-羟脯氨酸；化妆品；离子色谱

胶原蛋白是胶原的水解产物，是动物结缔组织中主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的天然功能性蛋白，占蛋白质总量的25%～30%[1-2]。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物功能活性，因此，在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛应用[3-4]。胶原蛋白在化妆品中添加量较低，样品基质复杂，前处理繁琐，因此其定量检测一直是化妆品功效评价及质量监控的难点。L-羟脯氨酸（L（-）-hydroxyproline，L-Hyp）是一种非必需氨基酸，是胶原组织的主要成分之一，且为胶原中特有的氨基酸，约占胶原氨基酸总量的10%，胶原蛋白含量可以根据L-Hyp含量乘以相应系数得到，因此，检测L-Hyp可反映胶原蛋白指标情况，例如，目前食品中胶原蛋白检测主要以L-Hyp作为有效指标[5-6]。

目前L-Hyp的测定方法主要为氨基酸自动分析仪、液相色谱/质谱联用法，但是该类设备相对昂贵。此外还有比色法、高效液相色譜法等，然而前者样品处理相对较为繁琐，且易出现假阳性现象，后者则需要对L-Hyp进行柱前衍生化，同样繁琐。因此，本文建立了一种离子色谱法（IC）检测化妆品中L-Hyp的方法，避免了昂贵仪器的使用，同时也简化了检测流程，为化妆品中胶原蛋白类含量的确定提供了技术支持，进而为化妆品生产过程中的质量控制以及后期的功效评价服务。

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

Dionex ICS3000离子色谱仪（配电化学检测器）；AminoPac PA10色谱柱（带保护柱）（Thermo Fisher）；Millipore超纯水仪；氮吹仪。

L-羟脯氨酸标准品（纯度>99%）；NaOH（Alfa Aesar 50%氢氧化钠）；醋酸钠（sigma-aldrich）；浓盐酸（12 mol/L，德国Merck公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取样品0.5 g（精确值0.1 mg）至安瓿瓶中，加入10 mL 6mol/L盐酸，氮吹3min后迅速热封；将安瓿瓶置于110 ℃恒温烘箱中水解22 h，水解产物转移至50 mL容量瓶，用超纯水定容至刻度。取1 mL定容后的水解液于40 ℃氮吹至干，加入1～2 mL超纯水继续氮吹至干，最后用1 mL 0.1mol/L盐酸复溶，0.22 μm滤膜过滤后上机。

1.2.2 标准曲线制备

精密称取L-羟脯氨酸标准品50 mg于50mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容至刻度得标准品储备液。分别取50μL，100μL，200μL，500μL，1000μL标准储备液于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸定容，制得系列浓度为5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL的标准溶液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：AminoPacPA10氨基酸专用分析柱（2×250 mm），保护柱（2×50mm）；流动相：A：超纯水；B：250mmol/LNaOH溶液；C：1mol/L醋酸钠溶液；流速：0.25mL/min；进样量：25μL；柱温：30℃；洗脱程序见表1。

2 结果与讨论

2.1 方法考察

2.1.1标准曲线、检出限和定量限

按1.2.2制备标准曲线，上机检测。以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为：y=4.7226x+79.891，R2=0.9998。结果表明，L-羟脯氨酸在5μg/mL～100μg/mL范围内呈良好线性关系，见图1。

2.1.2 重复性

取20 μg/mL标准品溶液6份，按1.2.1方法处理后上机检测，结果见表3，测得结果的相对标准偏差RSD为2.62%，表明该方法重复性良好。

2.1.3 样品加标回收率

选取已知L-羟脯氨酸含量的某市售化妆品，精密称取6份，分别加入20?g/mL标准品溶液1mL，充分混合后按1.2.1方法处理后上机检测，记录峰面积，根据线性方程计算样品中L-羟脯氨酸含量，得出相应回收率。结果表明，L-羟脯氨酸回收率在91.3%～98.9%，平均回收率为95.8%，相应的测定结果的RSD为3.4%（n=6）。该方法准确度良好。

2.2 样品测试

选取8个市售含胶原蛋白类化妆品样品，按本方法进行检测，结果见表4。羟脯氨酸作为胶原和胶原蛋白中的特殊蛋白质，其含量一般约为胶原氨基酸总量的10%，其含量是目前食品、保健品及动物组织中胶原和胶原蛋白定量的常用换算方法。因此，本方法以10为折算系数，计算化妆品中胶原蛋白含量（见表5）。从表中看见，这些宣称含有胶原蛋白的样品中所含胶原蛋白含量参差不齐，甚至有的含量为0，因此，消费者选购时需要注意。

3 结论

本文阐述了一种离子色谱检测化妆品中L-羟脯氨酸的方法，该方法灵敏度高，无需衍生化，无需昂贵的氨基酸自动分析仪，操作简单，可应用于含胶原蛋白类化妆品的检测和质量控制，为化妆品功能性成分日常检测提供技术参考。

参考文献：

[1] Hulmes DJ.Building collagen molecules，fibril，and suprafibrillar structures. J Struct Biol，2002，37（1-2）：2-10.

[2] Jerome AW，John AMRl.Immunology of collagen-based biomaterials.In：Donald LW.Biomaterials and bioengineering handbook.Marcel Dekker.Inc.USA，2000：739-760.

[3]王旭楠，郭立群，周洁，等.高效液相色谱法测定化妆品中胶原蛋白含量[J].日用化学品科学，2018，41（8）：10-13.

[4]蔡梅，吉文亮，刘华良，等，氨基酸自动分析仪对牛乳中羟脯氨酸快速测定方法研究[J].中国食品卫生杂志，2012， 24（6）：542-545.

[5]蔡伟江，陈晓霞.液相色谱—串联质谱法测定保健品中L-羟脯氨酸含量[J].食品安全质量检测学报，2015，6（02）：667-672.

[6]王旭波，徐利丽，郑洁，等.柱前衍生化-HPLC法测定市售3种胶类药材中L-羟脯氨酸和胶原蛋白的含量[J].中国药房，2017，28（27）：3824-3827.