Desulfuromonas alkenivorans S-7联合稻壳处理酸性重金属废水

佘臣杰,唐婕琳，何 环,2，张 朦，童 丽,唐 俊，陶秀祥,2

(1.中国矿业大学 化工学院，江苏 徐州 221116; 2.中国矿业大学 煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室，江苏 徐州 221116; 3.中国矿业大学 安全工程学院，江苏 徐州 221116)

笔者利用SRB菌株联合稻壳的简易生物反应器处理人工合成酸性重金属废水，分析酸性废水在处理过程中理化特性(Eh，pH，Ec)及金属离子(Fe，Mn，Cr)变化规律，并利用FT-IR分析稻壳和微生物联合处理作用下重金属离子的处理特性，分析SRB处理酸性重金属废水的金属沉淀的生物作用机制，希望通过这些研究为矸石山重金属污染治理提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

本试验采用的SRB菌株筛选自湖南湘潭某矸石山周边土壤，经分子生物学鉴定SRB菌属于Desulfuromonasalkenivoransz种，命名为DesulfuromonasalkenivoransS-7菌[14]。培养基基本组成如下:KH2PO4,0.5 g/L;NH4Cl,1.0 g/L;Na2SO4,0.5 g/L;60%乳酸钠,4.0 g/L;CaCl2·2H2O,1.0 g/L;MgSO4·7H2O,2.0 g/L;酵母提取物1.0 g/L;重金属废水中金属离子质量浓度(Fe3+60 mg/L,Mn2+25 mg/L,Cr6+60 mg/L)，调节培养基初始pH=3.0±0.2。在接S-7菌入反应器前，需对S-7菌株重复扩培3次以上保证SRB菌数量达到要求。

1.2 重金属酸性废水的生物处理

柱式反应器装置如图1所示。该反应器内径14.0 cm，高15.0 cm，有效容积2.0 L，反应器在使用前需用3.0 mol/L HNO3浸泡72 h，并用去离子水进行漂洗。填充稻壳取自湖南某大米加工厂，将稻壳洗净、晾干，灭菌置于105 ℃干燥后填充满整个反应器，从反应器顶部充入高纯氮(99.99%)，维持反应体系前期的无氧状态。试验中采用恒流蠕动泵从反应器顶部进重金属废水，通过循环水控温(30±1) ℃。

图1 柱式反应器示意Fig.1 Schematic diagram of column reactor1—废水储存器;2—出水阀;3—恒流泵;4—入料阀;5—反应器;6—夹套;7—喷淋头;8—微生物加样咀;9—取样咀;10—滤膜；11—入池阀;12—出水阀；13—回水阀；14—循环恒温水槽;15—回水阀;16—回收池出水阀;17—pH值检测装置;18—氧化还原点位Eh检测装置;19—电导率Ec检测装置;20—数据分析终端;21—废水回收池

本试验共设置2组试验:一组为接种SRB微生物组，另一组为空白对照组(仅填充稻壳)，并设置3组平行试验。试验组添加培养至对数生长期的S-7菌，接种量为10%，空白组则只添加灭菌培养基，将填充满稻壳的两组反应器通过蠕动泵加入2 L培养液，其中试验组反应器中SRB菌培养液30 ℃恒温培养4 d。试验组及空白组反应器中分别持续添加含混合重金属(Fe3+，Mn2+，Cr6+)合成废水。合成废水需每天在无菌条件下制备，并通入高纯氮(99.99%)10 min驱除氧气，然后通过恒流泵以100 mL/d的恒定流量从反应器顶部连续泵入反应器中处理。每天从反应器底部取样口取100 mL已处理的酸性废水样以维持SRB反应器总体积不变，试验组S-7菌液则通过流加法保证细菌浓度维持在同一数量级，尽量减少细胞浓度变化的影响。

1.3 样品采集和分析

每天从试验组与对照组中取5 mL样品用于分析反应器中处理液pH、氧化还原电位(Eh)、电导率(Ec)。每天取少量样液10 000 rad/min离心分离后取上清液，用1 mol/L硝酸处理后(防止金属沉淀或者吸附于细胞表面)采用原子吸收光谱(TAS-986，北京普析通用)测定淋溶液中3种代表性金属离子(Fe，Mn和Cr)浓度。从处理20 d的SRB反应器中取部分微生物组及空白对照组稻壳样品，真空冷冻干燥8 h，研磨成粉末;并从反应器中取酸性废水处理液于4 000 rad/min离心2 min收集沉淀，取离心后的上清液于10 000 rad/min离心10 min收集细胞，将收集的沉淀、细胞经真空冷冻干燥后，采用KBr压片法制样，用傅里叶红外光谱仪(Nicolet Nexus 670,Thermo Electron,Waltham,Massachusetts)对样品进行分析，测定光谱为4 000～400 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 S-7菌株和稻壳联合处理重金属废水理化特性分析

SRB联合稻壳处理酸性废水的pH,Eh和Ec变化曲线如图2所示。图2(a)为pH变化曲线，整体上看试验组SRB反应器培养液pH比空白组pH高。试验组酸性废水经处理前6 d其pH呈下降趋势，可能是S-7正处于生长迟缓期，随后pH整体呈上升趋势，处理8～11 d反应器中菌体进入对数生长期，pH上升较明显，这与体系发生还原反应产生了大量的溶解性硫化物例如H2S等，碱性条件下H2S起到中和作用，而酸性条件下H2S较容易从溶液中释放出来导致pH缓慢上升有关[15]。在11～14 d，菌体进入稳定期pH上升比较缓慢。在15～18 d 后pH基本维持稳定在6.20左右，18 d后略有下降趋势，这可能与S-7菌大部分处于衰退期或者SRB反应器中H2S的浓度达到一定上限，H2S超过一定浓度对SRB反应器中微生物有一定毒害作用[16]。研究表明pH值决定着游离H2S在总硫化物(HS-+H2S)中的比例，尤其当体系pH值<7.0时，游离H2S的含量较大，其对SRB有较强的抑制作用，使硫酸盐的还原速率较慢[17]。试验组尽管每天泵入SRB反应器中的酸性合成废水pH=3左右，但SRB反应器中整体pH维持上升趋势，且最终基本稳定在6.20 左右，这表明S-7处理酸性废水最大的优势在于可以提高废水的pH。而空白组SRB反应器处理的酸性废水整体呈下降趋势，主要原因是空白组SRB反应器中每天泵入酸性废水(pH=3.0左右)逐渐降低反应器中pH。图2(b)为SRB反应器处理酸性废水Eh的变化曲线，试验组SRB反应器中Eh在处理第1～11 d 整体呈下降趋势，最高下降至-360 mV，表明试验组SRB维持比较高的还原环境，有利于S-7菌的生长，且该阶段Eh波动比较大;试验组在处理后期(12～22 d)Eh基本维持稳定。在试验组SRB反应器中1～11 d S-7细胞大量繁殖，由此可推测S-7菌株Eh值的波动是由细菌大量繁殖引起，越到后期(11～22 d)Eh波动越小，SRB菌株的还原能力越弱。空白组Eh整体也维持在-200 mV左右，可能原因是反应器通过联合稻壳填充及通入N2维持反应器的厌氧环境。反应器中总离子浓度变化趋势的Ec曲线变化如图2(c)所示。试验组Ec在SRB处理1～4 d 明显升高，这与S-7菌在该阶段处于延滞期处理效果不明显基本一致。试验组在5～9 d电导率下降明显，而在11～22 d整体保持下降趋势，基本可认为SRB反应器中电导率的下降与S-7菌处理重金属废水使重金属沉淀去除有关。

图2 微生物组和空白对照组SRB反应器中酸性废水pH,Eh和Ec变化曲线Fig.2 Variation curves of pH,Eh and Ecin acid waste water in the SRB reactor of microbiome and sterile control group

2.2 S-7菌株和稻壳联合处理重金属废水金属离子变化

图3为反应器处理酸性废水中Fe3+,Mn2+和Cr6+质量浓度变化曲线。由图3可知，微生物组和空白组淋溶液中3种金属离子质量浓度均有变化，其中Fe3+处理效果最为明显，Mn2+次之，Cr6+变化最小。在处理前2 d，3种金属离子含量整体呈上升趋势，可知S-7菌的还原作用并不明显。试验组Fe3+质量浓度经S-7菌处理后最终质量浓度在0.72 mg/L 左右，去除效果明显(运行10 d，Fe离子去除率达95%以上);Mn2+处理质量浓度在5.20 mg/L左右(运行20 d，Mn2+去除率达79.2%)，而Cr离子经处理最终质量浓度在27.00 mg/L左右(其中Cr6+在运行前5 d，去除率达95%，后期Cr6+处理并不明显)。对比试验组与空白组金属离子的变化，可知SRB反应器中填充的稻壳对金属离子有一定的吸附作用。由图3(a)可知，Fe3+在S-7菌处理前期(2～10 d)，其质量浓度快速下降到0.50 mg/L左右，处理效果明显，处理后期(11～20 d)SRB反应器中Fe3+质量浓度基本维持稳定。空白组Fe3+质量浓度随进样时间的增加整体呈上升趋势。试验组Mn2+质量浓度变化趋势与Fe3+质量浓度变化趋势基本一致，去除效果最佳时期为第2～10 d。对比试验组与空白组Cr6+金属质量浓度，可基本判断S-7菌株对Cr6+去除效果并不明显。在处理第2～5 d，S-7菌株仍对Cr6+具有一定去除效果，但在处理第7～20 d SRB反应器中Cr6+质量浓度逐渐上升，基本与空白对照组中Cr6+质量浓度相近。

图3 微生物组和空白对照组SRB 反应器酸性废水Fe，Mn和Cr离子质量浓度变化曲线Fig.3 Concentration variation curves of Fe,Mn and Cr in acid waste water in the column reactor of microbiome and blank control group

由图3可知，前期废水中离子的去除速率相较于后期较明显，反应器处理后期由于离子共存对废水处理的影响使废水中金属离子质量浓度趋于平衡，从而出现动态的制约平衡[18]。动态制约平衡条件下很难将金属离子完全去除，因为当反应器中累积的离子浓度分别降到制约平衡浓度下限时，就会阻碍金属离子浓度继续下降。因此本试验金属离子去除效果较好的时间为前5 d，而后期金属离子去除效果并不明显的原因可能是后期随着金属离子含量的增大，反应器中金属离子的累积浓度达到S-7菌株的致死浓度，从而减弱了菌株的还原能力。也有研究表明铜和锌的两者混合对微生物的毒性比单一重金属的毒性更加显著[19-20]，因此试验中采用S-7菌株处理混合重金属废水，S-7菌株致死效应可能比较明显。由图3(c)可知，该SRB反应器对Cr6+的去除效果并不明显，可能原因在多种重金属离子存在条件下，S-7菌株处理金属的机制不一样，在Fe3+,Mn2+离子存在条件下，S-7菌株优先处理Fe3+,Mn2+离子，或者高浓度Cr6+的毒性使S-7菌株对Cr6+离子处理效果本身并不明显[21]。 SRB菌株处理含Cr6+的重金属废水时若体系中含有Fe2+离子对SRB的代谢有促进作用，可利用Fe2+和S2-生成FeS，然后利用FeS的强还原性还原Cr6+为Cr3+生成氢氧化物快速沉淀，同时生成的FeS沉淀既对微生物无毒性，又可以降低体系中硫化物的浓度从而减弱毒性[22]。也有可能反应器中的理化特性(尤其是pH)，并不是处理Cr6+的最佳理化环境。同时根据目前的处理结果推测菌株S-7对3种离子的去除机制可能存在差异，有可能也存在离子共存效应，其具体原因有待进一步研究。

2.3 S-7菌株和稻壳联合处理重金属废水FT-IR光谱分析

反应器处理酸性废水实验组及空白组中稻壳、细胞FT-IR图谱如图4所示。

图4 实验组及空白组SRB反应器中稻壳及细胞FT-IR图谱Fig.4 FT-IR atlas of rice husk and cell in SRB reactor of microbiome and blank control group

由图4可知，实验组及空白组稻壳两者出峰的位置并没有发生明显变化。其中实验组细胞在1 650 cm-1附近及实验组稻壳在1 058 cm-1附近的波峰吸光度均略微高于空白组，可能是由于两者之间存在不同官能团振动导致。由于稻壳及S-7细胞中许多官能团吸收带对红外图谱都有贡献，容易导致某一波数振动下发生谱峰叠加，因此很难确定吸收峰准确的出峰位置及其边界。鉴于以上情况，实验组和空白组的稻壳、细胞之间并没有明显的出峰变化，因此采用曲线拟合方法利用Peakfit软件对已测的红外光谱进行分峰拟合。根据图4 FT-IR的红外图谱，现将实验组及空白组的细胞、稻壳红外光谱在波数400～1 800，2 800～4 000 cm-1进行分峰拟合，稻壳分峰拟合图及细胞分峰拟合图分别如图5，6所示。

图5 空白细胞(a，b)和试验组细胞(c，d)在400～1 800和2 800～4 000 cm-1的FT-IR分峰结果Fig.5 Result points peak of FT-IR on 400～1 800 and 2 800～4 000 cm-1 of blank cells(a,b) and experimental cells(c,d)

图6 空白对照组(a，b)和试验组稻壳(c，d)在400～1 800和2 800～4 000 cm-1的FT-IR分峰结果Fig.6 Result points peak of FT-IR on 400-1 800 and 2 800-4 000 cm-1 of blank control group and experiment group rice husk

通过以上分析可以看出，S-7菌体处理重金属废水后，其表面吸附Fe,Mn,Cr离子后，羟基和胺基混合峰都增强，酰胺Ⅰ峰和酰胺Ⅱ峰都有略微的红移现象，羧基也发生了红移，说明在吸附这3种金属离子时，羟基、胺基、酰胺基及羧基是发生吸附作用重要的官能团，但S-7对3种金属离子的处理机制可能存在差异。

图6为稻壳的红外峰光谱，结合文献[23-25]相应波长处官能团的结果分析，原始稻壳在3 433 cm-1处出现的较宽吸收峰主要是由稻壳表面—OH和—NH2官能团的伸缩振动引起;2 902 cm-1处出现的峰是烷烃C—H的伸缩振动峰;1 650 cm-1处为羰基官能团的伸缩振动峰;1 520，1 460 cm-1吸收峰是芳香环烃类的不对称弯曲振动峰。由于组成稻壳的主要成分是纤维素，并且其中含硅量一般较高，所以1 000～1 100 cm-1和800 cm-1处的吸收峰主要是由Si—O—Si反对称和对称伸缩振动引起[22,24]，推测1 010 cm-1处的吸收峰可能是SiO—CH3的反对称伸缩振动引起。从试验组和空白对照组稻壳的FT-IR及分峰结果可以看出，处理重金属废水前后，其红外吸收整体谱线变化不大，其吸收峰变化较明显位置主要集中在1 060 cm-1，1 650 cm-1处，说明稻壳的Si—O—Si和羰基在处理重金属废水中可能发挥了作用。

3 结 论

(1)利用S-7菌株处理酸性重金属废水，能够明显提高酸性废水的pH。试验组在SRB反应器中每天持续添加pH 3.0的酸性废水20 d，酸性废水pH 最终稳定在6.20左右。S-7菌株对3种代表性重金属离子都有一定的处理效果，去除效率为Fe > Mn >Cr。

(2)S-7菌株在吸附这3种金属离子时，羟基、胺基、酰胺基及羧基是发生吸附作用重要的官能团，但S-7对3种金属离子的处理机制可能存在差异。同时稻壳的Si—O—Si和羰基在处理重金属废水中可能也发挥了作用。稻壳填充SRB反应器不仅为S-7菌株生长提供厌氧及寄居环境，也对金属离子去除存在一定程度的物理吸附作用。