Alda-1通过激活线粒体乙醛脱氢酶2改善大鼠肺缺血再灌注损伤

张裕坚，林婷婷，夏芳芳，董娇娇，金周晟，刘乐

（温州医科大学附属第一医院 麻醉科，浙江 温州 325015）

肺缺血再灌注损伤（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）广泛存在于各种临床事件中，如肺栓塞、肺移植、体外循环术等，期间形成活性氧自由基、炎症级联反应、钙超载、细胞凋亡等一系列病生理过程，严重影响患者的预后[1]。线粒体乙醛脱氢酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是机体内醛类物质代谢的关键酶，可将有毒性的醛类物质转化为无毒性的羧酸类物质起到解毒作用。近年来研究发现激活ALDH2 可减轻心[2-5]、脑[6]、肝[7-8]、肾[9]、肠[10]等脏器的缺血再灌注损伤。本研究在现有基础上，给予ALDH2 激动剂Alda-1对LIRI进行预处理，检测肺病理学、醛类物质和ALDH2，从而探求Alda-1减轻LIRI的保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年SPF级雄性SD大鼠，体质量300～350 g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号:SCXK（浙）2015-0001。丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（硫代巴比妥酸比色法，南京建成生物工程研究所）；大鼠4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）ELISA试剂盒（上海研谨生物科技有限公司）；兔抗β-actin多克隆抗体（美国Abcam公司，货号:ab8227），兔抗ALDH2单克隆抗体（美国Abcam公司，货号:ab108306），ALDH2 活性比色法检测试剂盒（美国Biovision公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及构建大鼠LIRI模型:参考钱小英等[11]的方法复制大鼠在体LIRI模型，采用随机数字表法将大鼠进行分组，分为假手术组（Sham组）、肺缺血再灌注组（I/R组）和Alda-1预处理组（Alda-1组），每组8只。Sham组开胸后仅显露左肺门，但不进行结扎；I/R组开胸后阻断左肺门30 min，再开放恢复供血和通气120 min；Alda-1组于缺血前1 h腹腔注射Alda-1（6 mg/kg），其余同I/R组。实验结束取大鼠动脉血用于测MDA及4-HNE；左肺上段置于4%中性甲醛溶液中固定，待作光镜病理观察；左肺中段用于肺湿干重比（W/D）测定；左肺下段用于MDA、4-HNE和ALDH2含量及活性的测定。

1.2.2 肺病理学改变:左肺上段固定后做成石蜡包块，切片，HE染色，并在光镜下观察肺泡形态、结构改变及肺间质充血水肿等情况。

1.2.3 W/D测定:取出左肺中段组织，滤纸吸净表面水分立即称重并记录湿重（W），然后置于80 ℃烘箱烘干24 h至恒重，称干重（D），求得W/D值。

1.2.4 血浆和肺组织的MDA、4-HNE醛类物质含量及肺组织ALDH2的活性:动脉血离心取上层血浆，

左肺下段组织匀浆离心取上清液，根据相应的试剂盒说明书检测MDA、4-HNE含量及ALDH2活性。

1.2.5 Western blot检测肺组织ALDH2蛋白相对表达量:左肺下段组织加入含1% PMSF的RIPA强效裂解液，匀浆提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度并配置上样蛋白。用SDS-PAGE分离胶10%，浓缩胶5%电泳，之后采用湿法转膜将蛋白转印至0.45 µm的PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭1 h，一抗稀释液配制ALDH2抗体（1:1 000）和β-actin抗体（1:1 000），将膜放入相应一抗液中4 ℃水平摇床孵育过夜，次日加入1:5 000的山羊抗兔IgG（H+L）HRP室温孵1 h，后加入ECL发光液，用凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）自动显影读取条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值。

1.3 统计学处理方法所有数据应用SPSS22.0软件进行统计分析。计量资料用±s 表示，3组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett’s T3检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺病理学改变Sham组肺泡结构基本完整，肺间质无明显充血水肿；I/R组大部分肺泡被破坏，肺泡璧明显增厚，腔内有大量的红细胞及水肿液聚集，肺间质明显水肿伴大量中性粒细胞浸润；Alda-1组较I/R组，肺泡破坏程度明显改善，腔内仅有少量红细胞渗出，肺间质水肿液明显减少（见图1）。

2.2 W/D值与Sham组相比，I/R组的W/D值显著升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与I/R组比较，Alda-1组的W/D值显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 血浆和肺组织MDA、4-HNE醛类物质含量的变化

I/R组的血浆和肺组织的MDA、4-HNE含量均高于Sham组（均P＜0.05）；Alda-1组的血浆和肺组织的MDA、4-HNE含量均低于I/R组（均P＜0.05），见表1。2.4 肺组织ALDH2的含量和活性变化 3组肺组织的ALDH2含量差异无统计学意义（P＞0.05）；但在ALDH2活性上，I/R组低于Sham组（P＜0.05），Alda-1组显著高于Sham组及I/R组（P＜0.05），见表2。

3 讨论

肺缺血再灌注过程中产生的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）夺取细胞膜不饱和脂肪酸侧链上的氢原子，启动脂质过氧化链式反应，进而生成大量的MDA（短链脂肪醛类）、4-HNE（中长链脂肪醛类）等毒性醛类物质。这些高活性的脂膜过氧化产物在体内可通过多种途径产生生物毒性，如作为内源性诱导因子促进细胞凋亡及自噬[12]，修饰含硫蛋白的相关位点，抑制有效蛋白生成或活性改变[13]，作为脂质过氧化的终末产物可诱导巨噬细胞的聚集活化，促进炎症发生[14]。对于肺组织而言，在保留通气的条件下发生缺血时，由于持续的氧气供给，诱导巨噬细胞/内皮细胞/炎症细胞产生较其他组织器官更多的活性氧自由基，进而形成大量的毒性醛类物质，因此机体对于肺组织内毒性醛类物质的代谢就显得尤为重要。

图1 各组肺组织HE染色图（×200）

表1 各组肺组织W/D及血浆肺组织MDA、4-HNE含量的比较（每组n=8±s）

表1 各组肺组织W/D及血浆肺组织MDA、4-HNE含量的比较（每组n=8±s）

与Sham组比:aP ＜0.05；与I/R组比:bP ＜0.05

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表2 各组肺组织ALDH2蛋白相对表达量及活性比较（每组n=8，±s）

表2 各组肺组织ALDH2蛋白相对表达量及活性比较（每组n=8，±s）

注:NAD为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。与Sham组比:aP＜0.05；与I/R组比:bP ＜0.05

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ALDH2是已发现的ALDH家族19个成员中对醛类代谢能力最强的同工酶，广泛参与体内醛类物质的氧化反应。近几年关于ALDH2与肺部疾病的关系研究也越来越多，CHEN等[15]发现DNA碱基切除修复蛋白XRCC1高表达的肺癌患者总体存活率较差，也许与ALDH2基因低表达，减少醛类代谢有关。AU YEUNG等[16]指出ALDH2突变与肺功能呈负相关，是肺功能不佳、可能发生慢性阻塞性肺疾病的遗传危险因素。研究表明Alda-1作为一种高选择性ALDH2小分子激动剂[17]，可以减轻醛类诱导的急性肺损伤和内皮屏障功能障碍[18-19]。

本研究显示，I/R组的肺组织损伤严重，但外源性给予Alda-1 预处理后，可明显减轻肺组织水肿、改善肺病理学变化，说明Alda-1对LIRI具有保护作用。I/R组的肺组织和血浆中堆积大量的MDA、4-HNE，而Alda-1组则改善了毒性醛类堆积的情况；但3组间的ALDH2蛋白相对表达量没有变化，只是ALDH2的活性发生了改变，这说明肺缺血再灌注过程并没有抑制ALDH2的合成，而是通过抑制ALDH2的活性造成醛类堆积，从而造成损伤；而Alda-1主要是通过激活ALDH2的活性，而并不是通过增加ALDH2的合成来发挥加速醛类物质代谢的作用。