吲达帕胺—β—环糊精包合物的制备、物相鉴定及体外释放度研究

宋美佳 韩景田 田宝成

摘 要 目的：建立吲達帕胺（IDP）-β-环糊精（β-CD）包合物的含量测定方法并优化其制备工艺，对所制包合物进行物相鉴定及体外释放度考察。方法：采用紫外分光光度法测定IDP-β-CD包合物中IDP的含量；采用溶液-搅拌法制备IDP-β-CD包合物，以包合率为考察指标，采用正交试验优化制备工艺；比较不同干燥法对包合率和载药率的影响；采用红外光谱分析（IR）法和差式扫描量热法（DSC）对IDP-β-CD包合物进行物相鉴定；通过体外释放度试验考察不同干燥法对IDP-β-CD包合物释放行为的影响。结果：IDP的检测质量浓度线性范围为2.0～14.0 μg/mL（r=0.999 7）；定量限、检测限分别为0.204、0.067 μg/mL；精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于2%；加样回收率为98.8%～101.8%（RSD=1.10%，n=6）。最优制备工艺为β-CD与IDP摩尔比为3 ∶ 1，包合时间为3 h，搅拌速度为300 r/min；所得包合物的平均包合率为72.81%。IR和DSC分析结果均显示，IDP与β-CD通过物理作用形成包合物。经喷雾干燥后，IDP-β-CD包合物的包合率为（60.96±0.25）%、载药率为（4.18±0.12）%；经冷冻干燥后，其包合率为（77.31±0.51）%、载药率为（5.31±0.27）%。12 h内，IDP 原料药、IDP-β-CD包合物（分别经冷冻干燥和喷雾干燥制备）的累积释放度分别为37.2%、42.5%、81.9%；与IDP 原料药相比，喷雾干燥所得IDP-β-CD包合物的累积释放度升高更为明显。结论：所建含量测定方法简便、准确；优化的包合物制备工艺稳定、可行，成功制得IDP-β-CD包合物，且喷雾干燥法可获得释放度更高的包合物。

关键词 吲达帕胺；β-环糊精；包合物；工艺优化；物相鉴定；体外释放

Study on Preparation Phase Identification and Release Rate in vitro of Inclusion Compound of Indapamide-β-cyclodextrin Inclusion Compound

SONG Meijia，HAN Jingtian，TIAN Baocheng（College of Pharmacy， Binzhou Medical University， Shandong Yantai 264003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for content determination of indapamide （IDP）-β-cyclodextrin （β-CD） inclusion compound， optimize the preparation technology， carry out phase identification and in vivo release study of it. METHODS： UV spectrophotometry was used to determine the content of IDP in IDP-β-CD inclusion compound. IDP-β-CD inclusion compound was prepared by the solution-stirring method and the preparation technology was optimized by the orthogonal experiment using inclusion rate as index. The inclusion rate and drug-loading rate were compared between different drying methods. Phase identification of IDP-β-CD inclusion compound was verified by IR and DSC. The cumulative release rate of inclusion compound was tested by in vitro experiment. RESULTS： The linear range of concentration of IDP was 2.0-14.0 μg/mL （r=0.999 7）. The quantitative limit and detection limit were 0.204， 0.067 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and repeatability tests were all less than 2%. The recoveries range was 98.8%-101.8%（RSD=1.10%，n=6）. The optimum technology conditions were as follows the molar ratio of β-CD to IDP was 3 ∶ 1， the inclusion time was 3 h， and the stirring speed was 300 r/min. Average inclusion rate of IDP-β-CD inclusion compound was 72.81%. IR and DSC analysis showed that IDP and β-CD formed inclusion compound through physical interaction. After spray drying， the inclusion rate and drug-loading rate of IDP-β-CD inclusion compound were （60.96±0.25）% and （4.18±0.12）%. After freeze-drying， the inclusion rate and drug-loading rate of IDP-β-CD inclusion compound were （77.31±0.51）% and （5.31±0.27）%. Accumulative release rates of IDP， IDP-β-CD inclusion compound （by freeze-drying and spray drying） were 37.2%， 42.5% and 81.9% within 12 h， respectively. Compared with IDP raw material， accumulative release rate of IDP-β-CD inclusion compound increased significantly after spray drying. CONCLUSIONS： Established method is simple and accurate. The optimal preparation technology of inclusion compound is stable and feasible. IDP-β-CD inclusion compound is prepared successfully. The inclusion compound prepared by spray drying shows higher release rate.

KEYWORDS Indapamide； β-cyclodextrin； Inclusion compound； Technology optimization； Phase identification； in vitro release rate

吲达帕胺（Indapamide，IDP）为噻嗪类利尿药（结构见图1），具有利尿和钙拮抗作用，是一种长效降压药，该药在发挥降压作用的同时，对心肌细胞及肾脏也表现出明显的保护作用[1]。由于IDP在水中溶解度极低，使得其在体内吸收较差、生物利用度较低，因此限制了其相关制剂的开发和应用[2-3]。β-环糊精（β-CD）为常用的包合材料，其水溶性较好且毒性较低，难溶性药物被其包合后，可使药物溶解度得以改善、溶出增加、生物利用度增大[4-5]。有研究发现，β-CD包合物不仅可以改善药物溶出，还可提高药物稳定性，改善药物的不良臭味[4-5]。为解决IDP生物利用度低和水溶性差的问题，本研究以β-CD为包合材料制备了IDP-β-CD包合物，通过正交试验以包合率为指标对处方工艺进行了优化，并对经喷雾干燥和冷冻干燥的IDP-β-CD包合物进行了物相鉴定及体外释药考察，旨在为其相关制剂的开发提供参考。

图1 IDP化学结构

Fig 1 Chemical structure of IDP

1 材料

1.1 仪器

TU-1901型双光束紫外-可见分光光计，包括光源、单色器、吸收池、检测器、显示器（北京普析通用仪器有限公司）；EL204型万分之一电子天平、TGA/DSC3+型热重及同步热分析仪（瑞士Mettler-Toledo公司）；SHZ-82A型恒温振荡器（金坛市科析仪器有限公司）；YC-015实验型喷雾干燥机（上海雅程仪器设备有限公司）；FDU- 2110型真空冷冻干燥机（日本EYELA公司）；Spotlight 400/400N型傅里叶变换红外光谱仪（美国珀金埃尔默仪器有限公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

IDP对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100257-200002，纯度：>99%）；IDP原料药（济南高华制药有限公司，批號：201501171，纯度：>98%）；β-CD（天津登科化学试剂有限公司，批号：20150923，纯度：>98%）；透析袋（截留分子量6 000～8 000 Da，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸盐缓冲液（pH 6.8，上海诺伦生物医药技术有限公司，批号：20180311）；无水乙醇为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 IDP含量测定

2.1.1 检测波长的选择 采用紫外分光光度法[6]测定IDP的含量。取IDP对照品、β-CD各10 mg，分别置于100 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，摇匀，得到对照品溶液、空白溶液。取所制得的IDP-β-CD包合物10 mg，置于100 mL量瓶中，加无水乙醇溶解，超声（功率：200 W，频率：40 kHz，下同）处理5 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取上述3种溶液各适量，于200～400 nm全波长范围内进行紫外光谱扫描，结果见图2。由图2可知，IDP对照品在242 nm波长处有最大吸收，β-CD在该波长处无吸收，IDP-β-CD包合物在242 nm波长处有最大吸收，空白辅料对测定无干扰，故确定检测波长为242 nm。

2.1.2 线性关系考察 取“2.1.1”项下对照品溶液适量，加无水乙醇稀释并定容，制成质量浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μg/mL的系列线性工作溶液，以无水乙醇作为空白对照，于242 nm波长处测定吸光度（y）。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得IDP的回归方程为y= 0.065 8x-0.009 7（r=0.999 7）。结果表明，IDP检测质量浓度线性范围为2.0～14.0 μg/mL。

2.1.3 定量限与检测限考察 取“2.1.1”项下对照品溶液适量，倍比稀释，分别按信噪比为10 ∶ 1、3 ∶ 1计算定量限、检测限。结果，IDP的定量限为0.204 μg/mL，检测限为0.067 μg/mL。

2.1.4 精密度试验 精密量取“2.1.2”项下系列线性工作溶液（质量浓度为2.0、8.0、14.0 μg/mL）适量，于242 nm波长处连续测定6次吸光度。结果，IDP吸光度的RSD为0.93%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取“2.1.1”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置2、4、8、10、12、24 h时于242 nm波长处测定吸光度。结果，IDP吸光度的RSD为0.89%（n=6），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取IDP-β-CD包合物适量，共6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，于242 nm波长处测定吸光度并代入回归方程计算样品中IDP的含量。结果，IDP的平均含量为2.12 mg，RSD为1.14%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 称取已知含量的IDP-β-CD包合物50 mg，共6份，置于100 mL量瓶中，加入一定量的IDP对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，于242 nm波长处测定吸光度并代入回归方程计算加样回收率，结果见表1。

2.1.8 样品含量测定 取IDP-β-CD包合物适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，于242 nm波长处测定吸光度，平行操作6次，并代入回归方程计算样品中IDP的含量。结果，IDP的含量在2.09～2.15 mg范围内。

2.2 IDP-β-CD包合物的制备

2.2.1 制备方法的确定 ①研磨法[7-8]制备。取β-CD 1.0 g，置于研钵中，加少量水研磨均匀；另取IDP原料药 0.3 g，加无水乙醇2 mL溶解后，将该溶液缓慢加入研钵中，继续研磨30 min至糊状；低温干燥后，洗去未包合的IDP，即得IDP-β-CD包合物。按公式计算包合率：包合率（%）=W包合物中的药量/W投药量×100%。结果，IDP-β-CD包合物的包合率为50.22%。②超声波法[9-10]制备。取β-CD1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加水10 mL溶解；另取IDP 原料药0.3 g，加无水乙醇2 mL溶解后，将该溶液缓慢加入具塞锥形瓶中，于60 ℃下超声处理30 min；低温干燥后，洗去未包合的IDP，即得IDP-β-CD包合物。按上述公式计算包合率。结果，IDP-β-CD包合物的包合率为59.93%。③溶液-搅拌法[11-14]制备。取β-CD1.0 g，置于圆底烧瓶中，加水20 mL溶解；另取IDP 原料药0.3 g，加无水乙醇2 mL溶解后，将该溶液缓慢加入圆底烧瓶中，于60 ℃下搅拌30 min；低温干燥后，洗去未包合的IDP，即得IDP-β-CD包合物。按上述公式计算包合率。结果，IDP-β-CD包合物的包合率为65.51%。

由上述试验结果可知，溶液-搅拌法制备的IDP- β-CD包合物的包合率最高，故本研究选择溶液-搅拌法作为制备方法。

2.2.2 制备工艺的优化 以β-CD与IDP摩尔比（A，n/n）、包合时间（B，h）、搅拌速度（C，r/min）为考察因素，以包合率（%）为考察指标，按L9（3）4正交试验设计进行工艺优化。因素与水平见表2，正交试验设计与结果见表3，方差分析结果见表4。

2.3 IDP-β-CD包合物的干燥

2.3.1 喷雾干燥法 按上述最优工艺条件制备IDP- β-CD 包合物，将包合物溶液于60 ℃水浴条件下保温，并用喷雾干燥机（进口温度：130 ℃，出口温度：90 ℃）干燥，然后以少量无水乙醇洗涤未包合的IDP，挥干乙醇，即得白色粉末状IDP-β-CD包合物。

2.3.2 冷冻干燥法 按上述最优工艺条件制备IDP- β-CD 包合物，将包合物溶液冷却至室温，然后置于-80 ℃冰箱中预冻4 h，再采用冷凍干燥机干燥12 h，然后以少量无水乙醇洗涤未包合的IDP，挥干乙醇，即得白色粉末状IDP-β-CD包合物。

2.4 IDP-β-CD包合物的包合率和载药率的测定

取“2.3”项下经不同方法干燥制备的IDP-β-CD包合物各100 mg，加无水乙醇适量，超声处理30 min，经0.45 μm微孔滤膜滤过；取续滤液1 mL，置于10 mL量瓶中，加无水乙醇定容。在242 nm波长处测定吸光度并计算包合率和载药率[载药率（%）=W包合物中的药量/W包合物的总质量×100%]，平行操作6次，结果见表6。

2.5 IDP-β-CD包合物的物相鉴定

2.5.1 红外光谱法（IR） 分别将IDP原料药、β-CD、IDP与β-CD的物理混合物及IDP-β-CD包合物与溴化钾混合后压片，于500～4 000 cm-1范围内进行IR扫描，结果见图3。由图3可知，图3C中IDP与β-CD的物理混合物的特征峰，为图3A（IDP原料药）与图3B（β-CD）特征峰的叠加，其强度和峰位置与IDP、β-CD基本一致；图3D与图3E中IDP-β-CD包合物的特征峰，与图3A（IDP原料药）特征峰对比可知，在IDP-β-CD包合物中，IDP各个峰的强度发生改变，分别为3 540 cm-1处的—NH2峰消失，1 642 cm-1处的酰胺Ⅰ带峰蓝移至1 700 cm-1附近且峰形变宽，1 590 cm-1处的苯环C=C伸缩振动峰强度增大。这提示IDP进入了β-CD的疏水腔中并与β-CD发生了相互作用，由于受三维空间的相互匹配性、范德华力、静电相互作用、疏水作用等因素影响，并未形成新的化学键[15]，表明IDP已通过物理作用包合到β-CD中。

2.5.2 差示扫描量热法（DSC） 分别将IDP原料药、β-CD、IDP与β-CD的物理混合物及IDP-β-CD包合物进行DSC分析，以空白铝坩埚作为参比，升温速度为10 ℃/min，N2流速为20 mL/min，温度范围为25～270 ℃[12-13，15]，结果见图4。由图4可知，图4A IDP原料药曲线的熔点峰为165 ℃；图4B为β-CD曲线；图4C为IDP与β-CD的物理混合物曲线，其中明显可见药物熔点峰；图4D、E分别为经冷冻干燥和喷雾干燥的IDP-β-CD包合物曲线，其与图4B曲线相似，且在165 ℃处未见IDP的熔点峰，表明IDP与β-CD形成了包合物，而非IDP原料中的晶体状态。

2.6 IDP-β-CD包合物的体外释放试验

精密称取一定量的IDP原料药、IDP-β-CD包合物（分别经冷冻干燥和喷雾干燥制备），以PBS混悬后置于透析袋内，将透析袋两端封紧后，放入含有释放介质（PBS）50 mL的锥形瓶中；将锥形瓶置于恒温振荡器上，设置温度为（37±5）℃、转速为100 r/min，进行体外释放试验。分别于振荡10、20、40、60、80、100 min和2、4、6、8、10、12 h时吸取锥形瓶内释放介质5 mL（并立即补充新鲜、等温PBS 5 mL），经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液适量，于242 nm处测定吸光度并计算累积释放度，结果见图5。结果显示，在12 h内，IDP原料、IDP-β-CD包合物（分别经冷冻干燥和喷雾干燥制备）的累积释放度分别为37.2%、42.5%、81.9%；与IDP原料药相比，2种IDP-β-CD包合物的累积释放度均有提高，但喷雾干燥的IDP-β-CD包合物提高幅度更为明显，提示包合作用可提高IDP在水中的释放速率，而喷雾干燥更有利于提高IDP-β-CD的释放度。

3 讨论

本研究以β-CD为包合材料，在单因素试验的基础上初步筛选了IDP-β-CD包合物的常用制备方法，确定了以溶液-搅拌法进行制备，并对其工艺进行了优化。IDP-β-CD包合物在水中较IDP原料药释放增加，表明包合作用可提高IDP在水中的释放速率。药物制剂方法及工艺参数对药物的溶解、释放可能产生较大的影响，因此本研究考察了冷冻干燥法和喷雾干燥法对IDP-β-CD包合物体外释放行为的影响。结果显示，与IDP 原料药相比，喷雾干燥法制备的IDP-β-CD包合物具有更高的释放速率。

IR法主要用于分析含羰基药物的包合作用，并可根据图谱中特征峰的降低或者消失以判断是否发生包合作用；而进行DSC检测时当药物被包合后，其结晶程度减弱，以致无法检测到药物的吸热峰，由此来判断包合作用是否生成[16]。本研究采用IR法和DSC法对IDP- β-CD包合物进行物相鉴定。结果均提示，IDP与β-CD通过物理作用形成了IDP-β-CD包合物。

综上所述，本研究所建含量测定方法简便、准确，可用于IDP的含量测定；优化的包合物制备工艺稳定、可行，并成功制得IDP-β-CD包合物，且采用喷雾干燥法可获得释放速率更高的包合物。

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（收稿日期：2019-01-08 修回日期：2019-04-21）

（编辑：陈 宏）