燃烧吧！独脚大仙

张岩峰

也许难以想象，但我们确实在做一件伟大的事儿，那可是制造传说中的家伙啊。

如果不是那个沉迷中国传说异兽，想法超多的企业家路易斯·刘，拿着《山海经》找到我们实验室，恐怕这个世界的人不会有机会亲眼见一见那只传说里的大鸟了。

这位头顶发量不太感人的矮个子商人虽然脑子里时常蹦出些稀奇古怪的点子，但他从商五十余载，很少做赔本买卖，这次，他更是派人认真做了调研，对书中的异兽进行了严格的筛选——

长着人脸的，不太现实。

能上天的水生物，再考虑考虑？

太简单、没技术含量的，没啥挑战性可不行。

最终，我们从书中400多只神怪中选出了最合心意的一只——毕方。

毕方简史

有鸟焉，其状如鹤，一足，赤文青质而白喙，名日毕方，其鸣自叫也，见则其邑有讹火。

——《山海经·西山经》

毕方，中国神话中火神的侍宠，又称火鸦。除了在《山海经》中的描述外，东汉著名天文学家张衡在名篇《东京赋》中也提到了这只神鸟。

因为跟火扯上了关系，在我国古代的神话传说中，毕方被认为是大火之兆。成书于万历十五年的辞典《骈雅》在解释毕方时只用了四个字——“兆火鸟也”。也有人考证毕方的名字可能来自竹子和木头（我国古代最主要的两种燃料）燃烧时发出的噼啪声音，集杂家大成的西汉著作《淮南子》中就有“木生毕方”的说法。

象征火的怪兽，似乎与生俱来地拥有驱逐鬼怪的能力。《韩非子》中记载毕方作为火的象征和黄帝蛟龙战车的旁侍，曾在泰山救驾，帮助黄帝躲避政敌的刺杀。

但在许多记载中，并没有说独脚怪毕方只有一条腿，所以很多人认为毕方其实就是火烈鸟。

比如火烈鸟的鸟喙有三种颜色，由上而下为白红黑，很容易被认作是白色的鸟喙叼着着火的炭火。而所渭的一条腿，我们也很容易联想到火烈鸟单腿休息的样子。

如果能以火烈鸟为原型进行试验，那么我们要做的就是利用基因编辑技术，让火烈鸟只长出一条腿。听着好像挺简单，但目前所知的地球生物中，还没有发现单数足的动物，所以这其实是个技术活儿。

并且，选择毕方还有个最大的好处，火烈鸟本身的栖息地之一也在西印度群岛，也就是我们实验室所在地，小岛的环境非常适合火烈鸟的生存，这无疑给毕方的建造，创造了非常优良的外部环境。

至此，Befun项目正式启动，取这个名字的时候，我的意图很明显，希望在整个实验过程中，所有人都能获得快乐。

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火烈鸟又名红鹳、红鹤，为一种大型水鸟，主要分布于非洲、中南美洲，以及印度等部分亚热带地区。它的脖子很长，常弯曲成S形，体高1～1.4米，翼展可达1～1.6米。化石证据表明火烈鸟祖先早在3000万年以前的中新世就开始分化，远早于大多数别的鸟类。

独脚兽，站起来

先弄掉一只腿试试？

足作为行走工具，从功能上讲需要对称，所以几乎所有动物的足都是偶数。然而，我们也发现，许多小型鸟，比如麻雀，在平地上却没有行走能力，只能依靠双腿一起快速频繁跳跃。

然而像毕方这样的大型鸟，单足跳几乎是无法想象的。只剩一只脚的鸟，虽然能够存活，但由于它原本细长的腿，无法适应跳跃和飞行落地时产生的冲量，很快便会出现腿骨骨折的现象，所以我们要在实验中注意加强腿的力量。而为了毕方在跳跃时保持平衡，它的腿还必须位于腹部正中。

最省事的办法是将鸵鸟的腿移植到火烈鸟身上，再加强单足的强壮度。但显然这并不是一个好办法。用过于简单粗暴的肢体拼凑得到的生物，和小说《科学怪人》中弗兰肯斯坦搞出的怪物没啥两样，并且移植的性状无法遗传，所以我们并不打算采用。

于是我们从基因编辑入手，先对火烈鸟的基因序列进行了检测，毕竟在鸟类演化的历程中，也并不存在单脚蹦跶的異类。托前辈们的福，21世纪初，国际鸟类基因组联盟就已经完成了对火烈鸟的基因组测序，并且进行了初步的比较基因组学研究，解释了一些鸟类进化的问题。50年后，对火烈鸟的全基因组关联分析也基本完成。有了这些研究基础，制造毕方完全有可能。

基因敲除初尝试

任何科研项目，在还是ldea的阶段都是靠谱的，然而真正开始实验了，就会出现非常多的问题。不过作为训练有素的实验生物学家，我们早就习惯了在解决问题的时候发现新的问题。

一开始我们尝试了最简单的基因敲除，有选择地敲除一条染色体上控制腿部发育的基因。基因敲除经过两百多年的发展，已经成为一项选择面极广的成熟生物技术。以CRISPR为模版基因的编辑技术，可以配合的蛋白非常多，单单Cas蛋白的改进版本就有不下200个，大肠杆菌TadA的进化也超过一百代。虽然咱不差钱吧，但显然要全部正交筛选一遍是不现实的。我们花了两周时间设计出上百个实验手段，从概率上来说至少能覆盖所有实验结果可能性的99.99999%。

另外，我们希望未来的毕方能形成种群，所以必须雌雄搭配。所以，我们分别对八对雌雄火烈鸟，其十六只进行了胚胎干细胞的基因敲除。尽管进行了优化，工作量还是无比巨大。我们花了3个月的时间种下了1600个希望的种子，然而令人沮丧的是最后啥也没得到。

绝大多数的胚胎在导入剪辑过的基因之后都没有发育，还有很多在发育过程中直接流产，唯一诞生的小毕方来自CRISPR/Cas-ZW-0917组。很遗憾，它虽然体征正常，但没有腿。经过数据分析，我们认为这极有可能受到了基因对称性控制的影响。就好比在人类和动物的某些遗传病中，出现一只手或一只脚的情况寥寥无几，但会出现一只正常发育，一只畸形的情况。

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根据达尔文的《物种起源》，小型鸟的两肢较短，由股部、胫部、跗部和趾部等部分组成，整个后肢肌肉都分布在股部和胫部，其他部位全是肌腱。这些肌腱贯穿至趾端，能控制足趾的弯曲，使其能握紧树枝。但由于后肢的胫部跗骨和跗部趾骨之间没有关节臼，胫骨和跗骨之间的关节不能打弯，这样就只能快速频繁地跳跃。

比较基因组学

Comparative Genomlcs，基于基因组图谱和测序技术，对已知的基因特征和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机制和不同物种亲缘关系的生物学研究。

全基因组关联分析

Genome-wide association study，指在人类全基因组范围内找出存在的序列变异，即单核苷酸多态性（SNP），从中筛选出与疾病相关的SNPs。

终止子

Termlnator，是一段位于基因或操纵组末端的DNA片段，可中断转录作用。

内源性病毒

Endogenous viral element，简称EVE，指非病毒生物体的生殖系基因组中一些来自病毒的DNA序列。其形成之前可能是感染生物体的病毒的整个基因组（原病毒），或病毒基因组的一些片段。当病毒的DNA序列融入生殖细胞的基因组后，可以随着生殖遗传到宿主的下一代，直到内源化为宿主基因的一部分，称为内源性病毒元件。

孤雄生殖

指在授粉过程中精核进入胚囊后，未发生核融合，卯核解体消失，由精核直接发育成种子胚，也称雄核发育。也就是用同性生殖细胞的结合产生后代。自然情况下，一些昆虫、鱼类、爬行类和鸟类可以通过孤雌生殖繁衍后代。

新思路！内源性病毒拼合

从生命的演化角度来看，我们好像在做一件逆天的事儿，但大段地敲除一条染色体上的基因，显然造成了成对染色体的长短不一，导致了过高的致畸率。当然，生物本身对染色体有一定的容错率，比如人类男性的一对性染色体就是XY，也并不对称。我们最初的实验设计，实际上就是在挑战火烈鸟基因中一对常染色体的容错率。但很不幸，我们赌输了。

定位到问题所在后，我们采取了第二套方案：在控制腿部发育的那段基因前后分别改造出三个终止子。我们企图通过这种方法让这段基因在胚胎发育中不被表达。不过遗憾的是，我们最终得到了一堆一腿正常一腿畸形的鸟宝宝。我们把siRNA和RNAi技术也应用进来，却反而提高了胚胎的畸形率，绝大部分胚胎没有发育，我们似乎又回到了原点。

虽然现在说起来云淡风轻，但在当时我们压力还是很大的。辛苦一年，什么都没得到。那段时间项目组的气压很低，大家都很萎靡。好在能继续尝试的想法还是很多的。这时，有病毒研究背景的研究员李剑提出了一个惊世骇俗的想法——利用内源性病毒。人类基因中有8%从未表达的基因，它们来自远古的内源性病毒。当年，这些逆转录病毒的RNA在转化为DNA后并没有把我们的祖先搞死，反而被人类基因封印，跟随着人类不断繁衍。我们尝试把人类基因中已知的17个内源性病毒片段分离并拼合出来，直接替代火烈鸟中控制腿部发育的那段基因的部分。这个ldea的工作量比之前所有实验的工作量都大很多，但在此时，任何新的想法都是值得一试的。

令人惊喜的是，这一次，我们成功了。

雌雄畢方

当这只编号为BEFUN-Ⅲ-0917的雌性单足小毕方真的出现在大家面前的时候，每位研究员都屏住了呼吸，生怕吵到这个眼睛还没睁开的小家伙。

在它腹部的正下方，那条小小的健康的腿，令所有人都心潮澎湃。

我的团队很快得到了九只小毕方，美中不足的是这九只均为雌性。我猜想是雄鸟基因兼容性较差。由于鸟类的性染色体跟人类相反，雌性为ZW，雄性为ZZ，所以雄性火烈鸟的染色体天然对称性高，对不对称的基因编辑的兼容性低。

不过，提高兼容性，有现成的办法。早在两百多年前对小白鼠的孤雄生殖研究中，中国团队就用观察畸形部位的方式来逆向推出非兼容的基因位点，进行定向融除。在分析了600多只雄性火烈鸟基因编辑的失败案例后，我们最终确定了7个位点。在把这7个位点定向敲除后，我们得到了健康的雄性毕方。

随后，我们采取人工培育的方式，筛选出下肢强大的毕方，进行人工繁殖，彻底解决了其下肢孱弱的问题。在人工培育的过程中，我们尝试用毕方跟火烈鸟进行交配繁殖，得出的结论是鸟卵无法正常孵化。这也就意味着，我们造出来的毕方，不会给生态带来任何影响。

燃烧的火红躯体

然而，现在的毕方，除了拥有强健的单足，似乎还差点什么。尽管我们在喂养它们时单独补充了虾青素，但毕方的羽毛颜色也只是比火烈鸟更红一些而已。直到某一天，李剑突然从自己发光的宠物金鱼身上得到了灵感，激动地跑来向我描述红色的毕方配上红色的荧光蛋白，一定会像火焰般美丽。

让生物发光是件有趣的事。早在1994年，著名化学家、诺贝尔化学奖获得者钱永健就开始研究改造GFP。后来，俄国科学院生物有机化学研究所的SergeyA.Lukyanov实验室也从一只颜色深红的海葵里发现了深红色荧光蛋白。而这与火焰相似的颜色，正是我们需要借助的。

在生物体中的实验表明，深红色荧光蛋白对生物体组织的穿透性远胜于其他颜色，但唯一的缺点就是稳定性不高。以往的应用都是把蛋白注射到哺乳动物体内，可到了毕方这里，红色荧光蛋白很快就会被降解。我们曾给毕方专门注射过深红色荧光蛋白，并且在傍晚时分的展示中得到了震撼的视觉效果。有经验的饲养员对毕方鸟群进行惊吓刺激，在肾上腺素的作用下，毕方鸟群像是一团燃烧的火。验收实验成果的刘老板呆呆地放下望远镜，嘴中喃喃道：“像火，真的像火！”沉默良久，老头赞叹说：“可不就是‘见则其邑有讹火吗！”然而代谢的加速也让红色荧光蛋白的降解变快，耀眼的火红在十几分钟内便消失了，天地一片空寂，除了毕方偶尔发出的响声。

要解决这个问题，还是得用基因工程来编码染色体，让它能自己制造红色荧光蛋白。几乎所有荧光蛋白的氨基酸序列和折叠方式都是已知的，包括深红色荧光蛋白的。我们在体外合成了大量这类DNA链条，把这段蛋白导入细胞。在接下来的实验中，实验小组分为了两个方向：一组尝试让其全身产生红色荧光蛋白，另一组则是令其羽毛产生红色荧光蛋白。然而基因编码后的毕方没有长出具有红色荧光蛋白的羽毛，我们猜测，在毕方鸟表皮细胞进行角质化衍生时（也就是长毛的时候），相关的角质化蛋白与红色荧光蛋白在功能上不兼容。

我们又把方向转向了虾青素。虾青素是一种类胡萝卜素，本身呈深粉红色，具有极强的抗氧化性。它的特点之一是与不同的蛋白结合，变成青色、蓝色。我们在研究中发现，毕方在基因改造后的特异蛋白与虾青素结合强烈，但可惜并未造成颜色的改变。

由于荧光蛋白所需能量直接来自氧气，所以如果我们能像血红蛋白那样，加入亚铁使之络合到目标蛋白上，是不是有可能让原本的红色变为可以发光的红色？我提出了这个想法。在提高了毕方血液中的亚铁离子浓度后，毕方的羽毛终于发出了红色的荧光。

意料之外的事情

这个世界上没有简单的事情，如果你觉得简单，多半是因为你还不够了解。

随着第一批毕方渐渐长大，我们发现了很多意料之外的事情。

一是毕方太大了。真的是太大了！第一代毕方，全都是雌性，基本还能保持正常火烈鸟大小，高一米左右，体重六七斤。但开始雌雄合群正常生育之后，毕方的子代便一代比一代大。仅用了十年，三代过后，毕方已经有两米高，五十斤重了。我们对第三代的毕方进行了长期跟踪研究，发现它们身体中生长激素对于性激素的响应比正常动物慢半拍。对几乎所有高级动物而言，性激素都会抑制生长激素的分泌。所谓成年，就是性成熟，也就标志着体型不再变大。但对毕方而言，大概是编码后的冗余DNA也有少量解码，编译成为新的蛋白，而这种蛋白具有提高生长激素抑制阈值的作用，所以我们观察到性成熟的毕方在体型上仍然可以增长约30%。最终，我们得到了人类见过最大型的会飞的鸟。

二是毕方很酸。鸟类的氮元素代谢跟哺乳类不同：哺乳类氮元素是变为尿素，鸟类是变为尿酸。可毕方由于体型太大，食物摄入量高，单靠尿酸搞不定，竟然自身进化出硝酸。在第三代毕方没有性成熟时，饲养员多次被毕方吐出的酸水烧伤，鸟蓬也很快腐朽不堪。我们赶紧定制了高聚物的鸟蓬，把小毕方转移进去。

当吐酸水的毕方长到两米高的时候，我们决定对它们进行雌雄分笼，再这么下去，谁也不敢保证，这家伙会不会戳破新做的家。

第三个说起来有点尴尬。毕方鸟具有富集放射性元素的能力，这是我们未曾料到的。而这还是在一次偶然的契机下，有人用胶片机拍摄毕方，底片却莫名其妙地被曝光。后来我们发现，底片之所以被曝光，是因为遭受了放射性照射。

人类目前已知的所有物种似乎并不存在这种能力，但放射性元素在生物体的不同器官中确实可以富集。以人体为例，进入血液中的放射性碘，约70%存在于血浆中，30%很快转移到体内各组织器官内，且呈高度不均匀分布。大部分放射性碘都選择性地富集于甲状腺，这导致在正常情况下，甲状腺内放射性碘的浓度可达血浆浓度的25倍，在供碘不足的情况下，其浓度可达到血浆浓度的500倍。所以，放射性碘对人体的危害主要表现为甲状腺辐射损伤。医学上也正是利用了碘在甲状腺中的富集行为，通过放射性碘-131治疗甲状腺疾病。

然而，毕方却是全身富集各类放射性元素。目前唯一可以确定的是，这与毕方的年龄和摄入物有关，未来可以朝着这个方向继续深究。

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红色并不是火烈鸟本来的羽色，而是来自其摄取的浮游生物。2008年荷兰莱顿大学的科学家弗朗西斯科·布达（Francesco Buda）教授和他的实验小组，通过精确的量子计算手段发现火烈鸟、三文鱼、虾、蟹等呈现出诱人的鲜红色的原因——虾青素。虾青素（Astaxanthin，简称ASTA）是一种天然抗氧化剂，在虾、蟹、鲑鱼、藻类等海洋生物身上可找到。火烈鸟通过食用虾、鱼、藻类、浮游生物等传递ASTA，使原本洁白的羽毛透射出鲜艳的红色。

实验手机

进入生物研究领域以来，我几乎每时每刻都在感叹自然万物的伟大。我们能想到、能见到的干奇百怪的生物，说到底都依赖DNA或RNA来遗传。所有生物的能量，也都来自线粒体制造的ATP。连我们造出的毕方，也无非是在为自然的伟大增加新的注脚。

有个秘密我谁也没告诉。在看到小毕方的那天晚上，我失眠了，但我很快乐。躺在床上，我越想越兴奋。我真实地感觉自己是站在一群巨人的肩上。

CRISPR技术最早来自对单细胞生物的研究。人类有免疫系统，那么单细胞的细菌靠什么来免疫呢？答案就是CRISPR，规律间隔成簇短回文重复序列。这些重复的序列，可以通过切断RNA和DNA的方式来对入侵的病毒进行抵抗。细菌的逻辑很简单，启动入侵DNA的细胞凋亡通路。所以CRISPR离不开自己的好基友Cas，这是诱发细胞凋亡的蛋白，平时沉默，一旦被激发，就跟CRISPR一起把指定的DNA切断。跟DNA、RNA、ATP一样，CRISPR也是大自然手中的一支画笔。

Befun项目的实现，利用了CRISPR，但不代表我们没有在这个基础上进行改进。实际上，基因编辑并不是简单的基因改写，我们几乎综合了当时所有最先进的生物技术。比如，我们还加入了基因沉默技术。当然，这依然是从人类封印的内源性逆转录病毒中得到的灵感。

在项目进行中，我经常会觉得自己踩着前人的脚步一路回溯，最终看到了生命的起点，看到了自然万物手中的那几支画笔。利用这些技术，我们一步步实现了最初的设想。尽管在制造过程中遇到了许多行不通的路，但对科学的探索信仰支撑着我们坚持下来，最终造出了传说中的神鸟毕方。