乳清液制备细菌纤维素条件的优化

王英男,黄艳玲 ,刘琳 ,杨文敏，吴磊，李佳栋

(1.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨 150028；2.黑龙江省科学技术情报研究院，哈尔滨 150028)

0 引 言

乳清是生产干酪、干酪素的副产品，是从牛乳中分离出来的总固形物含量为6.0%～6.5%的不透明的浅黄色液体[1]。一般每生产1 kg干酪可得到8～9 kg乳清。目前，全球乳制品加工排放的乳清液总产量约为（1.8～1.9）×108t/年，仅有约50%的乳清液被处理和使用，其中，被处理的乳清液中仅有30%用于生产乳清粉[2]。作为副产品的乳清产量，分别是主要产品干酪、干酪素产量的9倍和27倍。近年来，干酪成为全世界消费量唯一保持连续上升的乳制品。而我国对乳清的开发与综合利用则刚刚处于起步阶段，回收的乳清加工生产的产品较少，且未形成规模化生产，尚待进一步的加强。乳清的回收与利用对于提高产品质量、降低成本、增加企业经济效益，以及防止环境污染具有重要意义。从利用的量上讲，目前只利用了其中一小部分，而大部分乳清返回牧场作饲料或被排放掉，这不仅浪费了营养资源，降低了企业效益，而且也造成了严重的环境污染。因此，合理开发大量乳清资源已成为亟待解决的问题。

1886年Brow首次报道了细菌纤维素，其后，很多学者进行了大量的研究，尤其最近几年，国内外对于细菌纤维素制备与应用领域的研究更是层出不穷。2019年Khamkeaw[3]等人研究细菌纤维素活性炭作为去除水溶液染料的有效吸附剂，给水处理净化开辟了新的途径；Gayathri,G[4]等人以粗酒厂废水为廉价、经济有效的原料发酵生产细菌纤维素；张沙沙[5]等人利用木薯水解液为发酵培养基，有效提高了纤维素的产量；刘畅[6]等人研究各类条件生产细菌纤维素，阐述的比较详尽全面。细菌纤维素与植物纤维素相比具有很多优异的性质，主要表现为较高的纯度、不含半纤维和木质素等杂质；良好的生物相容性和生物可降解性；较好的持水性和复水率；较高的弹性模量等性质。因此，细菌纤维素被广泛的应用在食品、造纸、纺织和医学等领域[7]。本实验以乳品厂排放的乳清液为培养基的主要原料，探索生产细菌纤维素的新方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

木醋杆菌（Acetobacter Xylinum），由实验室分离纯化筛选而得。

1.1.2 原料与试剂

乳清液，由黑龙江鞍达实业集团股份有限公司提供；葡萄糖购于天津市天力试剂有限公司；酵母浸粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

斜面固体培养基：葡萄糖40 g，酵母浸粉10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 L。pH4.5，121℃灭菌15 min。

液体种子培养基：葡萄糖40 g，酵母浸粉10 g，蒸馏水1 L。p H 4.5，121℃灭菌15 min。

发酵培养基：乳清液培养基。121℃灭菌15 min。

1.2 实验仪器

主要仪器与设备(见表1)

表1 实验仪器

1.3 实验方法

1.3.1 乳清液的预处理

参照朱珠[8]的方法，并作适当的修改，具体处理方法：乳清液5 000 r/min离心10 min。

1.3.2 乳清液成分的测定

参照孟宏昌[9]的方法，并做适当的修改，具体方法如下：

总糖的测定：苯酚硫酸法；

蛋白质的测定：利用双缩脲法测定。

1.3.3 种子液的制备

挑取一环活化好的斜面菌苔接种于含100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30℃静止培养16 h。

1.3.4 细菌纤维素合成量的测定

参照崔思颖[10]的方法，并作适当的修改，具体方法如下：用蒸馏水冲洗细菌纤维素以除去膜表面培养基及杂质。用1%的NaOH溶液80℃水浴30 min，并持续用NaOH溶液浸泡至纤维素膜呈透明白色。再用蒸馏水冲洗，至纤维素膜为中性，60℃烘干至恒重并进行称量，干重为每100 mL培养液含有的干纤维素的质量，单位为g/100 mL。

1.3.5 发酵后培养液的处理及残糖的测定

参照张雯[11]的方法：细胞悬液10 000 r/min离心10 min；残糖的测定：苯酚硫酸法测定。

2 结果与讨论

2.1 乳清液成分测定结果（见表2）

表2 乳清液主要成分组成 （mg.mL-1）

2.2 葡萄糖添加量对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

添加葡萄糖补充木醋杆菌生长所需的碳源，使木醋杆菌更好的生长。经试验摸索及查阅相关文献，将葡萄糖添加量定为2%、4%、6%、8%、10%、12%，其他影响因素不变，结果如图1所示。

图1 葡萄糖添加量对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

由图1可知，在发酵温度30℃，发酵时间6 d，接种量6%，p H 4.5的条件下，随着葡萄糖添加量的增加，细菌纤维素的合成量以及葡萄糖的利用率先增加后减少，在葡萄糖添加量为8%时，细菌纤维素的合成量达到最大值0.81 g/100 mL，葡萄糖的利用率最大为96.89%。在葡萄糖添加量为10%和12%时，培养基溶液浓度过高，不适宜菌体的生长，所以纤维素的合成量及葡萄糖利用率较低。关晓辉[12]等人研究利用玉米浆干粉为发酵基质，确定葡萄糖最佳添加量为5%～6%，与其结果不一致的原因可能是玉米浆干粉中含有一定量的糖，而乳清液中含糖量较低需要补充较多糖作为微生物生长所需的碳源。

2.3 发酵时间对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

在发酵温度30℃，葡萄糖添加量8%，p H 4.5，接种量为6%的条件下，考察5、6、7、8、9、10 d对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响。

由图2可知，随着发酵时间的增加，细菌纤维素的合成量及葡萄糖的利用率呈现增加的趋势，从经济使用方面考虑，发酵的最佳时间定为7 d。与黄丹[13]等人的研究结果一致，其研究木醋杆菌生产细菌纤维素的最佳发酵时间为6～8 d。

图2 发酵时间对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

2.4 发酵温度对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

在葡萄糖添加量8%，p H 4.5，以6%的接种量接入液体发酵培养基中，分别在15、20、25、30、35℃条件下恒温静止培养7 d，结果如图3所示。

图3 发酵温度对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

由图3可知，随着发酵温度的升高，细菌纤维素的合成量及葡萄糖的利用率先增加后减少，在30℃时，细菌纤维素的合成量达到最大0.20 g/100 mL，葡萄糖利用率为98.50%。与钱子俊[14]的研究结果一致，其研究为利用大豆酶解液生产细菌纤维素，在发酵温度为28～32℃时，细菌纤维素的产量最大。

2.5 接种量对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

接种量的大小决定发酵周期的长短，采用适宜的接种量，可以缩短发酵周期，积累大量的产物。如果接种量过多或过少，都不利于菌体的生长和产物的积累，使得发酵周期较长[15]。

根据宗丹[16]等人的实验经验描述，选择考察接种量为2%、4%、6%、8%、10%、12%对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，在发酵温度30℃，葡萄糖添加量8%，pH 4.5，发酵时间为6 d的条件下，随着接种量的增加，细菌纤维素的合成量及葡萄糖利用率先增加后减少，在接种量为6%时，细菌纤维素的合成量最大为0.14 g/100 mL，葡萄糖的最大利用率为88.50%。与汤卫华[17]等人的研究不一致，其研究诱变的木葡糖酸醋杆菌生产细菌纤维素，当接种量为8%时，细菌纤维素的产量最高，原因可能是诱变的木葡糖酸醋杆菌采用较大的接种量时，才有利于产物的积累。

图4 接种量对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

2.6 初始pH对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

pH值对微生物的生产及产物的合成具有很大的影响，通常会改变菌体对底物的利用速度，从而影响产物的合成和积累[18]。p H值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响，结果如图5所示。

图5 初始pH对细菌纤维素合成量及葡萄糖利用率的影响

由图5可知，随着p H的增加，细菌纤维素的合成量及葡萄糖利用率呈现先增加后减少的趋势，在p H为5.0时，细菌纤维素的合成量最大为1.34 g/100 mL，葡萄糖的最大利用率为98.70%。与张沙沙[19]等人的研究结果一致。

3 结 论

通过实验确定了木醋杆菌生产细菌纤维素的最佳条件：8%葡萄糖添加量、发酵时间7 d、发酵温度为30℃、接种量6%、初始p H 5.0。在此条件下，细菌纤维素的产量为1.40 g/100 mL，葡萄糖利用率为97.5%。这与程建军[20]等人的研究结果是一致的。以乳清液为发酵基质生产细菌纤维素，不仅解决了乳清液对环境的污染，而且充分利用了资源，同时创造了一定的社会效益和经济效益。