超声细胞粉碎法提取射干总黄酮的工艺研究

齐建红

(西安文理学院 生物与环境工程学院,陕西 西安 710065)

射干(Belamcandachinensis(L.)DC)为鸢尾科多年生草本药用植物，在全世界被广泛用作民间药物，通常根茎入药，也有全草入药，具有清热消肿、止痛消炎等功效[1]。射干植物的主要药理活性成分为黄酮及异黄酮化合物[2，3]，刘建英等报道已经分离得到了20多个黄酮类化合物[4]。这类化合物药理活性广泛，在自然界植物中普遍存在,具有抑菌抗过敏、免疫调节、保肝抗血栓等药用保健作用[5]。那么如何高效充分利用这一有效成分资源，我们采用超声细胞粉碎这一能够破碎细胞，使有效成分充分溶出，操作简单快速的方法对射干植物中的主要药理活性成分工艺进行了优化研究。为植物射干的黄酮类成分在食品医药领域的进一步充分利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药材 实验材料射干，采自红河谷(陕西秦岭山脉)，经杜喜春老师鉴定为射干属植物射干，清洗阴干粉碎与密封袋中备用。

1.1.2 实验试剂及仪器 芦丁标准品，购买于陕西省药品检验研究所(纯度大于98%)，亚硝酸钠(NaNO2)、硝酸铝(AL(NO)3)和乙醇等实验试剂均为国产级分析纯。紫外-2450型紫外-可见分光光度计(Japan SHIMADZU)；RE100-Pro旋转蒸发仪(美国赛洛捷克)；JY92-2D型超声细胞粉碎机(宁波新芝)；电子天平(万分之一级)(German赛多利斯集团)。

1.2 实验方法

1.2.1 标品溶液的制备与最大吸收波长的确定 准确称取15 mg的芦丁标准品于50 mL烧杯中，加入一定量体积分数为60%的乙醇溶液充分溶解后，再倒入100 mL棕色容量瓶中稀释定容，混匀可得浓度为0.15 mg·mL-1的标准品溶液。精密量取1.0 mL标准品溶液，于10 mL的棕色容量瓶，根据参考文献[6]的实验步骤稍作修改，最后加水定容，摇匀，静置15 min。在波长为450～550 nm的区间扫描进行最大吸收波长的检测。

1.2.2 样品溶液的制备 根据参考文献[6]的方法稍作修改，精密称取1.1.1项下的射干粉末5.0 g于烧杯中。加入体积分数为60%的一定量乙醇溶液，在一定温度下于200 W条件下超声细胞粉碎法提取一定时间后，将提取液用旋转蒸发仪进行减压抽滤即得上清液。提取3次，合并上清液备用。

1.2.3 标准曲线的绘制[7]精密量取0.15 mg·mL-1芦丁标准品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00 mL放置于10 mL棕色容量瓶中，按照1.2.1项中的方法依次加入试剂。在504 nm波长处测定其吸光度(A)值，以芦丁标准品浓度(mg·mL-1)和A值进行黄酮标准曲线绘制。

1.2.4 正交试验设计 通过不同的单因素试验筛选，对射干总黄酮的主要提取效率的影响因素乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和料液比(D)进行了L9(34)水平的正交设计实验，从而优化筛选射干植物中最佳工艺。

1.2.5 样品分析 对正交试验溶液按照1.2.3项下方法显色，再进行A值的测定，最后计算射干植物中总黄酮的得率。

2 结果与分析

2.1 检测波长的确定

从图1可看出，芦丁标准品在450～ 504 nm 波长范围内A值呈上升趋势，当波长在504～550 nm范围内，A值呈现下降趋势，从而得出最佳波长测定值为504 nm处。

2.2 绘制芦丁标准品曲线

通过对1.2.3项中不同浓度A值进行测定分析可得回归方程为Y =12.68X + 0.004，R2= 0.999。芦丁在0.0 ～ 0.75 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好(图2)。

表1 因素水平

图1扫描检测波长结果

图2标准曲线

2.3 方法学实验结果与分析[8]

2.3.1 精密度试验 精密吸取上述芦丁标品(0.15 mg·mL-1)溶液3 mL，按照1.2.3项的方法，以不加芦丁标品为空白，用紫外测定504 nm波长处的A值，依次测定6次，得平均A值为0.683，RSD 为1.16%，可以得出仪器的精密度正常。

2.3.2 稳定性试验 准确吸取射干样品溶液3 mL，按1.2.3 项中的方法进行显色，分别间隔0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60min，在504 nm波长处进行A值的测定，结果在1 h 内A值没有显著变化，且RSD值为1.17%，表明射干样品溶液在1 h内的显色结果是稳定。

2.3.3 重现性试验 精密称取射干6 份，按照1.2.2和1.2.3项下的方法制备样品溶液并进行测定，得RSD值为1.35%，表明该方法重现性非常良好。

2.4 正交实验结果

从正交数据和方差分析结果可知，提取温度(℃)要素对射干植物中总黄酮成分的提取结果的影响最为显著，其次为乙醇浓度(%)因素，再次为固液比(g·mL-1)，最后为提取时间(min)。可以得出实验的最优提取组合条件为A2B2C3D1，射干中总黄酮的最佳工艺为乙醇浓度为80%，提取时间为10 min，固液比为1∶20，提取温度为90℃时，射干植物中总黄酮的含量为4.635 mg·g-1。

表2 正交设计结果L9(34)

表3 正交方差分析结果

3 结论

射干植物在全世界被广泛用作民间药物，并且射干植物中的主要化学成分黄酮类药理活性广泛。为了高效充分利用这一有效成分资源，我们对比以往射干植物的提取方法，采用超声细胞粉碎的方法，对射干植物中的主要药理活性成分总黄酮的提取工艺进行了优化研究。试验结果表明，试验的最优组合条件为A2B2C3D1。射干植物中总黄酮成分的含量为4.635 mg·g-1。该方法能够破碎细胞，使有效成分充分溶出，操作简单快速，并且得率较高。为射干资源的充分利用以及在食品医药领域的研究提供科学的理论参考。