蒸发光散射法测定重组人生长激素注射液中泊洛沙姆188含量

文/陆春燕 董世建 许 培 李增礼 王荣海（安徽安科生物工程<集团>股份有限公司）

生长激素是垂体前叶分泌的一种单链肽类激素。上世纪60年代，尸源性生长激素已开始用于治疗生长激素缺乏的患者；1985年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准重组人生长激素（rhGH）用于治疗儿童生长激素缺乏症（GHD）；此后20 多年，FDA 陆续批准重组人生长激素用于治疗慢性肾功能不全、HIV 感染相关性衰竭综合症、Turner 综合症、成人生长激素缺乏症、Prader-Willi 综合症、小于胎儿龄、特发性矮身材、短肠综合症等11 种适应症[1,2]。随着临床研究不断深入，rhGH 的应用范围不再局限于FDA 批准的适应症，其在神经系统疾病如缺血缺氧性脑病、脑外伤、脑性瘫痪、阿尔茨海默病以及烧伤领域、辅助生殖等方面均有一定的临床意义[3]。

泊洛沙姆188，一种高分子非离子表面活性剂，是优良的药物制剂新辅料，无毒，对皮肤黏膜无刺激、无过敏性，对人体十分安全，现已广泛应用于制药工业，主要作乳化剂、稳定剂、增溶剂和分散剂[4]。本文研究的重组人生长激素注射液是本公司自主研发的一种重组蛋白药物，目前已批准生产，其制剂处方中含有泊洛沙姆188。

随着药品质控标准的不断完善，国家药品审评中心对重组蛋白药物中的药用辅料含量的准确控制越来越关注，一般会要求企业建立分析方法对辅料含量进行控制。《中国药典》2015年版中未记载泊洛沙姆188 含量测定方法[5]，文献也鲜有报道泊洛沙姆的检测方法。本着对药用辅料含量的质控原则，本文建立了蒸发光散射检测重组人生长激素注射液中泊洛沙姆188 含量的方法，并进行了较为系统的方法学验证。

一、材料

1.主要材料和试剂

泊洛沙姆188，甘露醇，组氨酸，注射用水，重组人生长激素注射液，乙腈。

2.主要仪器设备

高效液相系统Waters2695，蒸发光散射检测器Waters2424，Empower3 操作软件，电子天平。

二、方法与结果

1.泊洛沙姆188 对照品贮备液和对照品溶液的配制

称取泊洛沙姆188 对照品40mg，置于10mL 容量瓶中，用注射用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液；取对照品贮备液1mL，加3mL 注射用水稀释，混匀即得对照品溶液。

2.色谱条件

以TSK gel G3000SWXL（7.8mm×300 mm，5μm）为色谱柱；以25%乙腈为流动相，流速0.6mL/min、柱温25℃；样品室温度4℃；漂移管温度60℃；气体压力0.193MPa；增益因子300，数据率1；进样量30μL。

3.专属性考察

分别取空白溶液（稀释液）、阴性对照样品（除不含泊洛沙姆188 外，其他组分与重组人生长激素注射液相同）、泊洛沙姆188 对照品溶液、重组人生长激素注射液，按前述色谱条件依次进样，考察方法专属性。泊洛沙姆188 对照品溶液和重组人生长激素注射液中均含目标峰，而空白溶液及阴性对照样品在泊洛沙姆188 保留时间左右无吸收峰，可证实目标峰（保留时间14.373min）为泊洛沙姆188。其峰形良好，与相邻峰（甘露醇）分离度良好，且无其他色谱峰干扰测定，表明本方法专属性良好。色谱图见图1。

图1 空白（A）、阴性对照样品（B）、泊洛沙姆188 对照品（C）和重组人生长激素注射液（D）的色谱图

4.系统重复性

精密量取泊洛沙姆188 对照品溶液，按照前述色谱条件连续进样6 次，计算泊洛沙姆188 色谱峰保留时间和面积的，结果分别为0.10%和0.70%，表明仪器系统重复性良好。

5.线性范围考察

取泊洛沙姆188 对照品贮备液，用注射用水稀释分别 制成系列浓度为1.6mg/mL、1.4mg/mL、1.2mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL，按前述色谱条件分别进样测定。以泊洛沙姆188 对照品浓度的常用对数（）为横坐标，峰面积的常用对数（）为纵坐标，进行线性回归，确定线性范围。回归方程为=1.2978+3.3759，2=0.9989，表明泊洛沙姆188 在质量浓度0.2～1.6mg/mL 范围内，线性关系良好。

6.精密度（重复性）

取同一批次重组人生长激素注射液6 支，用注射用水3 倍稀释后，按前述色谱条件分别进样测定，计算泊洛沙姆188 色谱峰保留时间和面积的，结果分别为0.06%和0.74%，精密度良好。

7.准确度

分别取泊洛沙姆188 对照品储备液0.4mL、0.5mL、0.6mL 各3 份，置于2mL 容量瓶中，加适量重组人生长激素药液后，用注射用水定容至刻度，摇匀，制成泊洛沙姆188 浓度分别为0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL 的溶液（相当于供试品中泊洛沙姆188 含量80%、100%、120%的重组人生长激素供试品溶液）各3 份，按照前述色谱条件分别进样测定，考察低、中、高3 个浓度的回收率。3 个不同质量浓度的泊洛沙姆188 的回收率分别为99.91%、99.93%和101.38%。

8.耐用性试验

改变流速。将色谱条件中的流速分别设定为0.54mL/min、0.6mL/min、0.66mL/min，其余色谱条件不变，分别进样，外标法测定供试品中泊洛沙姆188 含量，考察流速对测定供试品中泊洛沙姆188 含量的影响。结果显示，同一供试品在3 种不同流速下，含量测定结果为0.48%。

改变载气压力。将色谱条件中的载气压力分别设定为0.172MPa、0.193MPa、0.214MPa，其余色谱条件不变，分别进样，外标法测定供试品中泊洛沙姆188 含量，考察载气压力对测定供试品中泊洛沙姆188 含量的影响。结果显示，同一供试品在3 种不同载气压力下，含量测定结果为0.21%。

改变漂移管温度。将色谱条件中的漂移管温度分别设定为54℃、60℃、66℃，其余色谱条件不变，分别进样，外标法测定供试品中泊洛沙姆188 含量，考察漂移管温度对测定供试品中泊洛沙姆188 含量的影响。结果显示，同一供试品在3 种不同漂移管温度下，含量测定结果为0.43%。

9.重组人生长激素注射液中泊洛沙姆188 含量测定结果

按照上述蒸发光散射—高效液相方法，测定3 批重组人生长激素注射液中泊洛沙姆188 含量，结果分别为标示量的95.67%、95.67%和95.00%，符合标准规定中规定的泊洛沙姆188 含量应为标示量的90.0%～110.0%。

三、结论

重组人生长激素注射液是一种重组蛋白药物，其中的辅料泊洛沙姆188 无紫外吸收，所以选择蒸发光散射检测器检测。本实验参考徐佳茗等的文献[6]，基于高效液相技术采用蒸发光检测器，通过较为全面的方法学验证，建立了重组人生长激素注射液中泊洛沙姆188 的含量测定方法。验证结果表明，空白溶液对测定无干扰，泊洛沙姆188 峰能够与重组人生长激素注射液中其他组分峰完全分离；系统重复性及样品测定精密度良好；泊洛沙姆188 在质量浓度0.2～1.6mg/mL 范围内线性关系良好（2=0.9989）；低、中、高3 个不同质量浓度的泊洛沙姆188的回收率分别为99.91%、99.93%和101.38%；该色谱条件对流速、载气压力和漂移管温度耐受性良好，可用于测定重组人生长激素注射液中泊洛沙姆188 的含量。该方法还可为其他重组蛋白药物中泊洛沙姆188 的含量测定提供方法学参考，有利于质量控制。