酱香型白酒的轮次酒以及“二次制曲”过程中的风味物质分析

戴奕杰，李宗军，田志强，杨金川

（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550016）

中国白酒风味物质的形成现已发现是美拉德反应和存在于大曲、酒醅和窖泥中的微生物及其酶的催化反应之间的相互重叠作用的结果。酱香型酒用的高温曲以小麦为原料，其本身含有大量的酶和蛋白质，制曲过程淀粉转化为糖，蛋白质分解成氨基酸，加上堆积发酵的高热能条件下氨基酸和还原型单糖发生美拉德反应生成酱香物质，主要成分为醛、酮类和吡嗪类化合物，还有氨基酸脱氨脱羧反应形成许多的高级醇，都是酱酒香味的前体物质[1]。随着研究的深入和检测手段的改进，人们又提出了吡嗪类[2-5]、呋喃类和吡喃类衍生物[6-8]、高沸点酸性物质和低沸点酯类物质的复合香气是酱香型白酒的主体香的观点[6，9-17]。但是，至今酱香型白酒主体香仍没有一个明确的结论。

目前，关于酱香型白酒特征香味的产生主要涉及两个方面，非酶褐变反应和酶法褐变反应，前者以“美拉德反应”为主要研究方向[1，18-19]，后者是由多酚的氧化反应引起的[20-21]。由于酱香酒的香味成分种类多样，关系复杂，其间的量比谐调关系对酱香风味影响较大，只有在适量的前堤下，才能对酒质起到较好的作用，一但打破应有的动态平衡体系，就会给酒体带来负面影响。因此，进一步地深化酱香白酒的关键香味及形成机制，对建立改善酱香白酒品质的方法提供理论依据。但是由于酱香酒生产工艺特殊，使得成分复杂且关键风味物质很难分析，是行业内迫切攻破的难关。另外，气相色谱、液相色谱、气质联用分析等新技术的出现，为曲酒香味成分分析提供了利器。

本文利用气相色谱（gas chromatography，GC）技术对七轮次酒和堆积发酵阶段各酒醅样本的部分风味物质进行定量检测，进一步加深对酱香型白酒风味物质形成机制的认识和理解。与此同时，将结合酒醅微生物群落结构特征、酶系变化规律、理化性质等进行综合分析，探究影响酱酒酒质的主要因素，为将来进行功能微生物菌属鉴定及改善曲酒生产工艺提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酒醅采样

按照传统酱酒的酿造工艺，在贵州某酒厂酿造过程中进行采样。跟踪生产车间中某一口窖池，对其整个酱香白酒生产发酵工序进行取样。酒醅样本的取样从下沙、造沙和七轮次发酵过程的高温堆积、窖池发酵工序中进行固定点位的采取，取样方法为：对高温堆积和窖池发酵酒醅的上、中、下层进行取样，各层面进行3 个重复，共9 个抽样点。将上述采样位点的样品破碎并混匀后，分装于无菌袋封装标记，冻冷保存。样本信息如表1 所示。

表1 酒醅样本采集信息表Table 1 Acquistion information table of fermented grains

1.1.2 轮次酒取样

按1.1.1 的取样步骤，在跟踪对酒醅取样的同时，对相应生产轮次所产的轮次酒进行采样。具体方法为选取500 mL 密闭容量瓶分别对7 个轮次酒熟糟上甄蒸酒取酒，取样量为每个轮次500 mL，酒样放于避光阴凉处进行贮存以备检测。样本信息如表2 所示。

1.2 仪器与设备

7890A 气相色谱仪（配 FID）：美国 Agilent 公司；Agilent HP-INNOWAX（60 m×0.250 mm×0.25 μm）：美国Agilent 公司；Cleanert EC 碱性硅藻土固相萃取柱（填料4 000 mg 柱容量12 mL）：博纳艾杰尔科技。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂标准液及样品预处理

1.3.1.1 试剂标准液配制

将 950 μL 60%乙醇及 50 μL（20 g/L 标液）混匀，对此标准储备液进行稀释，浓度梯度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 g/L。

1.3.1.2 酒醅样品前处理

酒醅和大曲样本各取10 g，分别与10 mL 60%乙醇混合，振荡40 min 后，5 000 r/min 冷冻离心10 min，过滤膜后上机。

取10 g 酒醅样品放入用封口膜包好的三角瓶中，同时加入20 mL 的去离子水，混匀，静置30 min 后，吸取8 mL 混合物于装有3 g 氯化钠与磁石的20 mL 顶空瓶中，放置磁力搅拌器上搅拌15 min 后，将项空瓶置于50 ℃水浴锅中恒温萃取45 min，萃取完毕后将萃取头取出，插入气相色谱进样口热解析6 min，用于气相色谱分析。

1.3.2 酱香型白酒香气化合物的含量检测

1.3.2.1 色谱条件

载气氮气，流速1 mL/min；进样口温度：230 ℃；柱温：起始温度 40 ℃（8 min），以 5 ℃/min 速率升至 70 ℃（5 min），再以 10 ℃/min 速率升至 180 ℃（10 min），最后以20℃/min 升至240℃（7min）；分流比：20 ∶1；检测器温度：250 ℃，氢气流速：40 mL/min；空气流速：200 mL/min。

1.3.2.2 数据统计分析

本文利用R 语言对各数据集进行标准差计算，标准差描述各数据偏离平均数的距离（离均差）的平均数，它是离差平方和平均后的方根，用s 表示。标准差是方差的算术平方根。标准差能反映一个数据集的离散程度，标准偏差越小，这些值偏离平均值就越少，反之亦然。其计算公式见图1。

图1 标准差计算公式Fig.1 Formula for calculating standard deviation

2 结果与分析

2.1 轮次酒风味物质检测

轮次酒中风味物质成分检测结果见表3。

表3 轮次酒中风味物质成分检测Table 3 Component testing of flavor characteristics in rounds wine g/L

续表3 轮次酒中风味物质成分检测Continue table 3 Component testing of flavor characteristics in rounds wine g/L

从表3 可以看出来，7 个轮次的新酒中检测出醇、酯、醛、酸类物质，种类共计38 种，其中醇类14 种、酯类14 种、醛类4 种、酸类6 种。含量最高的为正丙醇，在一轮次酒中可达6.76 g/L，并且在前6 个轮次酒中均保持着较高的含量。含量最低的为苯甲酸乙酯、2-苯基乙酸乙酯，在一轮次酒中均只有0.01 g/L，并且在7个轮次酒中均处于低含量水平。观察整个试验数据，大体上多数物质均在中间轮次（三、四、五轮次）中维持着较高含量，这为中间轮次产优质基酒提供了重要的物质前提。轮次酒中各物质含量及种类偏少，需要再进一步按照酱香白酒储存要求进行多年的储存后才可生成丰富的酱香风味物质体系。

2.1.1 醇类物质

由表3 数据可以看出，醇类物质中以正丙醇的含量最高，其他醇类均处于较低的含量水平，整体含量最低的为苯乙醇。其中2-丁醇、2-戊醇、1-己醇在一轮次酒中未检出，从第二轮次中方才检出，2-丁醇在七轮次酒中未检出。已有研究报道，正丙醇是酱香白酒中检测含量较高的一类醇，同时其也是形成酒体爽口的重要物质保证。另外，醇类相对于其他成分沸点较低，因此容易挥发，并可带着其他物质一起挥发，从而起到助香的作用。

2.1.2 酯类物质

中国白酒中四大主要酯类物质为己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯，在试验的7 个轮次酒样中均有检出，其中以乳酸乙酯及乙酸乙酯的含量最高，乳酸乙酯在二轮次酒中可达到2.98 g/L，乙酸乙酯在一轮次酒中可达到2.85 g/L。酯类物质是组成白酒独特风格的重要化合物，其在酒体中主要可以表现出微甜、带涩，并还可以体现出一定的苦味和刺激感。

2.1.3 有机酸类

有机酸类物质是酱香白酒中重要的风味物质组分。试验样酒中共检出有机酸类6 种，含量最高的为乙酸，在第二轮次酒中可达到1.48 g/L，且在各轮次酒中均维持较高水平含量。含量较低的为异丁酸，在第五轮次酒中达到低值0.02 g/L。三甲基丁酸在第一、二轮次酒中没有检出，其他酸均在各轮次中检出。酸类物质在酱香白酒中的作用为催化酒体老熟，有机酸所释放出来的H+可以在各物质中间发生氢键缔合作用，使酒体趋于醇厚、绵柔，另一方面有机酸也可以增强酒体后味，其中一些高沸点的有机酸还可以提升白酒的丰满度和醇和度，消除白酒的糙辣感。

2.1.4 醛类物质

醛类物质在白酒中含量不高，此次试验在样酒中共检出4 种醛类物质，常见的乙醛和乙缩醛均有检出，乙醛含量较高，在第五轮次酒样中可达到2.31 g/L，而乙缩醛始终处于较低的含量水平。醛类物质主要是糖转化为乙醇过程中的中间产物，也可由氨基酸分解代谢产生。普遍认为醛类物质含量过高对于酒体口感不利，认为生产中的操作不当及卫生条件不好，会导致糖化不良、醅糟染菌，最终造成糠醛、甘油醛和丙烯醛的产生，达到一定量时会给酒体带来明显的糙辣味。因此，实际生产酿造中要严把工艺质量关，控制醛类物质的产生，保证酒质。各类物质总量对比见表4。

由表4 可知，4 类物质的总体趋势均为在第四、五轮次中维持较高含量，后在第六、七轮次中下浮较大。其中以醇类物质的总量最高，在第四轮次中达到15.50 g/L，其次为酯类物质，在前5 轮次期间其含量在5.85 g/L～6.9 g/L 区间进行上下浮动变化。酸类物质含量在7 个轮次中变化幅度最小，最高值也只是在第三轮次中的2.09 g/L。总体来说，轮次新酒中的物质含量及种类均不如储存后的基酒或成品酒中丰富，原因就在于后期的长达3 年～5 年的存放过程，漫长的储存期可以使得酒体中物质种类更加丰富，以醇、酯、醛、酸类物质为基础，进一步发生化合反应，最终缔合成酱香风味物质，同时也使得酒体更趋于醇厚、协调。

表4 各类物质总量对比Table 4 Total content comparison g/L

2.2 酱香型白酒酒醅发酵过程中风味物质检测

酱香白酒酿造工序中醇类物质的分析检测结果见表5。

表5 酱香白酒酿造工序中醇类物质的分析检测Table 5 Alcohol analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

如表5 所示，共检测出的醇类物质有14 种，其中在下沙和糙沙阶段大多数醇类物质没有检出，只有1-辛醇是从下沙阶段即可检出的，另异戊醇在糙沙堆积阶段开始有所检出。在一轮次起窖时，多数醇类物质可被检测出，但与后面轮次比较，仍有2-丁醇、正丁醇、异戊醇、3-辛醇、2-辛醇、1-己醇未被检出，之后几乎在每个轮次中均能检出14 种醇类物质。多数醇类物质含量处于“两头低、中间高”的变化趋势，先是逐渐上升，到达最高值后维持一段时间又开始下降，此类物质有2-丁醇、异丁醇、2-戊醇、正丁醇、异戊醇、1-戊醇、3-辛醇、2-辛醇、2-糠醛，变化幅度最大的为异戊醇，从糙沙堆积阶段的0.05 g/kg 醅上升至四轮次起窖时的1.40 g/kg 醅，增加幅度达到30 倍。有些物质变化幅度较小，处于较为平稳的状态，有甲醇、1-辛醇、1-己醇、苯乙醇，基本都是处于2 倍～3 倍的变化幅度，且整体含量较低。其中在含量上以苯乙醇的变化幅度最小，在0.02 g/kg～0.03 g/kg 醅之间，且从数值上看，苯乙醇也是所有醇类物质中各轮次含量最低的。正丙醇含量最高，在一轮次起窖时即达到了7.11 g/kg 醅，之后处于下降趋势，但在各轮次中均是含量最高，从六轮次起窖时即开始快速下降，直至六轮次下窖时达到最低值0.28 g/kg 醅，下降幅度达到25 倍。与轮次酒相比，各轮次起窖时糟醅中所含醇类物质从种类和含量上来看均较为高效地被提取入酒体中，成为轮次酒中关键组分。酱香白酒酿造工序中酯类物质的分析检测见表6。

表6 酱香白酒酿造工序中酯类物质的分析检测Table 6 Estersl analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

如表6 数据所示，酯类物质在酿造工序中可检测出的为14 种，其中白酒重要的四大酯——己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均有检出。在下沙和糙沙阶段可检出的酯类很少，只有到糙沙起窖阶段才有少量的乙酸乙酯及乳酸乙酯被检出，其他酯类均是在一轮次起窖时才被检出。含量最高的为乙酸乙酯，其从糙沙起窖时的0.06 g/kg 醅一直上升至五轮次起窖时的3.78 g/kg 醅，其次为乳酸乙酯，在第三轮次起窖时可达到0.81 g/kg 醅，含量最低的为2-苯基乙酸乙酯，在七轮次起窖时仅仅只有0.01 g/kg 醅。部分酯类依然遵循着先上升后下降的趋势，在中间轮次（三、四、五轮次）达到最大含量值，有乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯为第四、五轮次达到含量最大，只有戊酸乙酯是在第三、四轮次到达最高含量，其余酯类物质无明显的变化规律。可以看出，在酒质较好的中间轮次中，四大酯中有3 种是达到了其酿造过程中的最高含量，且四大酯的含量总体上明显高于其他酯类。酱香白酒酿造工序中酸类物质的分析检测见表7。

表7 酱香白酒酿造工序中酸类物质的分析检测Table 7 Acid analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

由表7 看出，从酿造工序中共检出酸类物质共6种，其中乙酸、丙酸、异丁酸从下沙阶段即可检出，丁酸、己酸在一轮次起窖阶段可检出，唯独三甲基丁酸直到二轮次下窖时才有检出。其中乙酸含量最高，在下沙阶段即有较高值1.83 g/kg 醅，后小幅下降又有回升直至三轮次起窖时达到最高值2.37 g/kg 醅，含量最低的为三甲基丁酸，在0.03 g/kg～0.07 g/kg 醅范围内变化。乙酸、异丁酸、己酸均符合先上升后下降的趋势，其中异丁酸在二轮次起窖时即达到最高值0.35 g/kg 醅，后直到七轮次时都处于较高的含量。丙酸在下沙阶段即达到了0.79 g/kg 醅，后在糙沙阶段迅速下降至0.22 g/kg 醅，再小幅上升至四轮次起窖时达到中期最高值0.53 g/kg醅，整体上变化幅度较小。酸类物质从含量上看在整个酿造工序期间均变化幅度较小，着也为酱香风味的形成提供了稳定的物质保证。香白酒酿造工序中醛类物质的分析检测见表8。

表8 酱香白酒酿造工序中醛类物质的分析检测Table 8 Aldehydes analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

表8 酱香白酒酿造工序中醛类物质的分析检测Table 8 Aldehydes analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

如表8 所示，醛类物质是可检出的物质中数量最少的，只有4 种。乙醛、乙缩醛在下沙和糙沙阶段均无检出，只有到一轮次起窖时才有检出，糠醛则是到一轮次下窖时才检出。5-甲基糠醛从下沙堆积阶段即可检出。4 种醛类物质含量大体上符合先上升后下降的趋势，总体含量较高的为糠醛，在五轮次起窖时即达到2.34 g/kg 醅，含量较低的为乙缩醛，一轮次起窖时检出含量为0.07 g/kg 醅，后经过小幅的上升直至六轮次起窖时达到最高值0.26 g/kg 醅。乙醛在初始检出的含量仅为0.18 g/kg 醅，后随着酿造过程的继续，直至五轮次起窖时含量上升10 倍达到最高值1.75 g/kg醅。5-甲基糠醛在下沙堆积阶段仅检出含量为0.26 g/kg醅，其后有大幅的上升直至一轮次起窖时达到1.33 g/kg醅，从一轮次开始，5-甲基糠醛的检出含量就一直维持在较高的数值（大于或接近于1 g/kg 醅），直至七轮次起窖。四类物质总量随酿造工序变化见图2。

由图2 可以看出，总体上醇类物质含量远远高于其他3 类物质，含量上有规律：醇>酯>醛>酸。酯类物质在下沙阶段没有检出，其他3 类物质从下沙开始均有存在。醇类物质总量在一轮次起窖时即达到高值7.98 g/kg 醅，后又不断攀升，直至第三、四轮次期间均维持在>11 g/kg 醅的高值。酯类物质的种类虽然与醇类一样多，但其总量却远远低于前者，虽然也明显高于醛类与酸类，但只是小幅度地高于两者。酯类物质含量自糙沙阶段的0.14 g/kg 醅开始，至第四、五轮次达到最高值6.88 g/kg 醅。醛类物质虽然比酸类少两种，但其总量略高于酸类，由下沙阶段的最低值0.26 g/kg 醅一直上升至第四、五轮次达到最高5.50 g/kg 醅。酸类物质含量总体上最低，最高值出现在三轮次起窖时3.42 g/kg 醅。四类物质仍是在中间轮次时保持着较高的含量，这为中间轮次酒的酒质提供了丰富的物质保证。而在七轮次时，相对于下沙初始，均还保持着一定含量，但七轮次的酒质已经处于较差的状态，并且糙沙起窖时的含量处于较低的水平。这也从侧面证明了对于酱香白酒的酿造，其中各物质含量偏低的话无法为酒体风味形成提供物质基础，只有达到一定含量后才能使得量变发生质变，方能影响到酒质的形成，所以推测酱香白酒酿造过程中各类物质含量及其比例是形成酱香风味的关键前提所在。

图2 四类物质总量随酿造工序变化Fig.2 Total content variation of the four types of materials during fermentation process

3 结论

范文来等[22]在文献中提到，生产试验发现，酱香型白酒的第一、第二轮次酒偏清甜，第三、第四、第五、第六轮次主要产醇甜和窖面酱香型酒，并且全面总结了酱香酒风味物质的特征和形成途径。酱香型白酒风味种类繁多，在化学键、分子间力等作用下，风味物质间相互聚合，形成了复和、独特的风味[23]。本研究从堆积发酵过程中，采集酒醅和轮次酒样本，检测其中存在的微量成分及其含量，以期总结出酱香型白酒的风味特性。

1）轮次酒：醇类含量最高的是正丙醇，该物质可影响白酒口感，总体随着发酵工序的进行，后面轮次酒中的正丙醇含量降低；各轮次酒中均检出种类丰富的酯类物质，其中是以乙酸乙酯的相对含量最高，丰富的酯类构成酱香型白酒的重要香气组分，随轮次酒的增加先升后降。有机酸中含量最高为乙酸，乙酸是乳酸菌以葡萄糖所分解的乳酸为底物产生，同时生成乙醇和二氧化碳及其他有机酸类，而乙酸又是形成乙酸乙酯的前体物质。醛类物质以乙醛含量较高，醛类作为中间产物影响酒质，醛类除糠醛外其他研究较少。总体趋势均表现在第三、第四、第五轮次酒中维持较高的含量，为优质基酒的产出提供物质前提。醇类物质起主导，形成各轮次酒的典型符合酱香风味。

2）酒醅：醇类物质总体上呈现先上升后下降的趋势，依旧是正丙醇含量最高，起窖高，下窖低。含量最高为乙酸乙酯，其次为乳酸乙酯呈现先升后降趋势，且中间轮次达到最高值，乳酸菌和梭杆菌属对酱香型白酒风味形成和口感密切相关，表现为Escherichia-Shigella 和乳杆菌在发酵中期，起窖时丰度高；芽孢杆菌还在窖泥中能代谢产生酯类物质，同时分泌脂肪酶和产生有机酸，堆积下窖时的脂肪酶活性高，Clostridium-sensu-stricto-1 在中期的含量也表现相同的规律。酸类变化幅度较小，乙酸含量最高。醇、酸、酯类物质在窖池发酵的含量高于堆积发酵阶段，说明高温堆积将部分前体物质带到窖内进行分解，并在酒体中高效提取，成为轮次酒中的关键组分。有机酸与醇类物质酯化产生酯类，因此醋酸菌和乳酸菌对酯类形成起重要作用。醛类物质整体变化趋势为逐渐上升再下降。糠醛的总体含量高，5-甲基糠醛前期下降，后期上升。中间轮次酒保持较高含量，为酒质提供丰富的物质保证。