响应面法优化大枣复合香料的提取及其在卷烟中的应用

张晓旭　连培康　顾程程　郭磊　罗娟敏　徐达　张玮韬　苏加坤　蔡继宝

摘要 以大枣为主要原料，辅以枸杞和苹果干进行复配，采用果胶酶酶解的方法制作大枣复合烟用香料。以酶添加量、酶解温度、酶解时间为考察因素，在单因素试验的基础上，以出汁率为考察对象，采用Box-Behnken 中心组合设计结合响应面优化分析法优化大枣复合香料的提取工艺，并对制备香料进行了卷烟加香试验。大枣复合香料的最优提取工艺：酶添加量25.1 mg/L，酶解温度35.6  ℃，酶解时间1.8 h，在此条件下复合提取物出汁率达到81.03%。大枣复合香料在卷烟中的应用结果表明，大枣复合香料具有增甜增润作用，能够有效降低口腔刺激性，减轻杂气，改善余味，在“金圣”烟丝中的最佳添加量为0.3%。

关键词 大枣;酶解;响应面优化;卷烟;加香试验

中图分类号 TS41文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0186-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.17.053

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract Jujube was used as main raw material to mix with lycium barbarum and dried apple and prepare jujube compound spice for tobacco by using pectinase enzymatic hydrolysis method method.On the basis of single factor test，  the addition amount of enzyme， the temperature of enzymatic hydrolysis and the time of enzymatic hydrolysis were taken as research factors， the extraction rate of juice was taken as research object， the BoxBehnken center combination design and response surface optimization method were used to optimize the extraction process of jujube compound spice， and incenseadding experiment of cigarette was conducted on the prepared spice.The optimal extraction technology of jujube compound spice were as follows：enzyme adding amount of 25.1 mg/L， enzymolysis temperature of 35.6  ℃， enzymolysis time of 1.8 h.Under these extraction conditions， the juice yield of compound extract reached 81.03%.The application of jujube compound spice in the cigarette showed that jujube compound spice could enhance sweetness and moistening， and effectively reduce the irritation of mouth and offensive taste， and improve the aftertaste.And its optimum addition amount was 0.3% in Jinsheng cigarette brand.

Key words Jujube;Enzymolysis;Response surface optimization;Cigarette;Incenseadding experiment

大枣为我国特产，在我国己有4 000多年的栽培史[1]，是集药、食、补三项功能于一体的保健食品[2]。大枣中含有多种不可溶性纤维、可溶性纤维、碳水化合物、还原糖、多糖、蛋白质、脂质和水分等，且矿物质元素丰富[3-4]。此外，大枣还富含许多生物活性成分，如有机酸、香豆素类衍生物、三萜类物质、大枣多糖、儿茶酚、黄酮类、腺苷类、皂苷类、生物碱、甾醇、鞣质等[2，5-7]。

目前，大枣在食品、保健品、化妆品、烟草等行业都具有广泛的应用。在食品行业中，大枣多用于制备复合型保健饮料[8-11]。关于大枣多糖的研究也有较多报道[12-14]。在烟草行业，大枣浸膏芳香成分对卷烟有醇和烟气、降低烟气粗糙感、改善口感的作用[15]，是烟草加料工艺中一种传统的烟用添加剂，由于其具有与烟香协调，能改善卷烟的吸味及香气品质的作用，在国内各卷烟企业均有普遍应用，但大多数研究都集中在单体香料提取上[15-17]，而關于复合酶解提取大枣烟用香料则鲜有报道。酶解技术可以提高香料提取率，多种天然植物与大枣进行复配可丰富香韵，加入卷烟中增加烟香。笔者以大枣为主要原料，以枸杞和苹果干为辅料进行复配，再利用酶解技术进行提取和响应面工艺优化，并进行卷烟加香研究，以期提高大枣的综合开发与利用价值，提高卷烟品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料。苹果干，购自江苏中蔬农业有限公司;大枣购自温县鼎鑫商贸有限公司;枸杞，购自安徽汇中州中药饮片有限公司;果胶酶，购自诺维信酶制剂公司，型号KT513on，酶活力为5 000 U/mg。

1.1.2 仪器。

打浆机，购自曲阜汇富机械有限公司;APV-1000型均质机，购自北京同和友德科技有限公司;BLXK-JA3003B型电子天平，购自上海精科实业有限公司;JW-2021HR高速冷冻离心机，购自上海赵迪生物科技有限公司;MNMJ-54A高压蒸汽灭菌锅，为北京中西远大科技有限公司产品;DZF-6030A真空干燥箱，购自天津通净仪器设备有限公司;烘箱、恒温恒湿箱均为Binder公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 大枣复合物提取工艺流程。

大枣、枸杞、苹果干（复合物配比为4∶3∶3）→挑选→清洗→预煮软化→加1.5倍的无菌水打浆→护色→过滤→酶解→离心→过滤→均质→大枣复合提取物。

1.2.2 出汁率测定。将酶解后的红枣复合物3 500 r/min离心25 min，取上清液，过滤得到澄清汁，按以下公式计算出汁率：出汁率=澄清汁/原浆质量×100%。

1.2.3 单因素试验。

1.2.3.1 酶添加量。设定酶解时间为2.0 h，酶解温度为25 ℃，分别在酶添加量为5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L下，进行大枣复合物酶解制备试验。

1.2.3.2 酶解温度。设定酶添加量为25 mg/L，酶解时间为2.0 h，分别在酶解温度为25、30、35、40、45、50、55、60  ℃下，进行大枣复合物酶解制备试验。

1.2.3.3 酶解时间。设定酶添加量为25 mg/L，酶解温度为40  ℃，分别在酶解时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h下，进行大枣复合物酶解制备试验。

1.2.4 响应面试验。在单因素试验结果的基础上，选取酶添加量为20、25、30 mg/L，酶解温度为35、40、45  ℃，酶解时间为1.5、2.0、2.5 h，采用响应面分析法优化大枣复合香料制备条件。响应面试验因素与水平见表1。

1.2.5 加香与评吸。将大枣复合香料用蒸馏水稀释后，使用喷雾器均匀喷洒在“金圣”某款卷烟烟丝上，按照卷烟正常生产流程卷制成成品烟，再在（22±2） ℃、相对湿度（60±5）%条件下平衡48 h后，由一个7人评吸小组参照郑州烟草研究院单体/香精作用评价标准进行感官评吸[18]，然后计算总分求平均值，以感官评吸分数为指标，考察大枣复合香料在卷烟中的应用。对照组为添加等量蒸馏水的卷烟。

2 结果与分析

2.1 大枣复合香料提取的单因素试验

2.1.1 酶添加量。从图1可以看出，随着酶添加量的增加，复合提取物出汁率不断增大，当酶添加量为25 mg/L时，出汁率较高，当酶添加量大于25 mg/L时出汁率变化趋于平缓。当使用果胶酶的浓度不同时，对大枣复合提取物出汁率的影响也不同。一般而言，随着果胶酶的使用浓度提高，果胶酶酶解提取物的细胞壁，有效破坏了细胞组织，提高了出汁率，但当酶添加量达到一定数值后，出汁率的增加不再明显，但因使用果胶酶而增加的成本支出却明显变多。同时，果胶酶本身属于蛋白质，同时果胶本身具有悬浮颗粒的能力，若添加过量会引起酶解提取物浑浊。因此，从经济综合成本和提取物品质的角度考虑，酶添加量为25 mg/L左右比较适宜。

2.1.2 酶解温度。从图2可以看出，随着酶解温度的升高，出汁率呈先增后减的变化趋势。当酶解温度为40 ℃时，大枣复合提取物出汁率较高。这可能是因为温度对果胶酶活性具有双重作用，低温时抑制酶活性，高温时易使酶失活。当温度低于40 ℃时，果胶酶活力尚未达到最高值，大分子果胶水解程度不够。果胶酶本质为蛋白质，当温度超过40 ℃后，蛋白质发生变性，导致酶解速度减小。同时，长时间高温可能导致酶促褐变现象严重，对成品品质不利，因此酶解温度为40 ℃左右比较适宜。

2.1.3 酶解时间。从图3可以看出，随着酶解时间的延长，出汁率先增加而后趋于稳定。当酶解时间为2.0 h时，复合物出汁率较高。这主要是因为果胶分子比较大，当酶解时间少于2.0 h时酶解还不够充分，未能切断成小分子果胶;当酶解时间为2.0 h时，大枣复合物酶解适度;当酶解时间超过2.0 h时，大枣复合物中的果胶和纤维素均被充分水解，这可能会增加可溶性固形物含量，但会造成大枣复合物的黏度和浊度下降。因此，酶解时间为2.0 h左右比较适宜。

2.2 响应面法对大枣复合香料提取条件的优化

2.2.1 响应面法优化设计结果。单因素试验结果表明，酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）对大枣复合香料的提取有较大影响，因此选取这4个因素为考察对象，以复合提取物的出汁率为响应值，进行响应面试验，结果见表2。

2.2.2 数学模型的建立及显著性分析。应用Design-expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到大枣复合提取物出汁率（Y）的二次回归拟合方程：Y=80.69+2.44A-1.54B-0.58C+2.63AB-5.37AC+3.20BC -6.12A 2 - 2.38B 2-3.64C 2（其中，A为酶添加量，B为酶解温度、C为酶解时间）。方差分析结果表明，大枣复合物酶解制备模型的F=1.524×10 6，P<0.000 1，表明试验所采取的二次模型是顯著的。失拟项的P值为0.070 5，这表明大枣复合物酶解制备的模型与实际情况的拟合程度较好，因此可采用此模型来预测大枣复合提取物的制备条件。对大枣复合提取物的制备条件进行分析，结果发现酶添加量、酶解温度和酶解时间均为显著因素。

2.2.3 响应面分析。方差分析结果显示，AB的交互作用、AC的交互作用、BC的交互作用均达到显著水平，响应面图见图4～6。根据大枣复合提取物制备试验结果和回归方程各项的方差分析，由响应面分析法优化得到大枣复合提取物制备的最佳条件如下：酶添加量25.1 mg/L，酶解温度35.6 ℃，酶解时间1.8 h，在此条件下出汁率达到81.03%。

2.2.4 验证试验。为验证上述响应面分析法优化得到的大枣复合提取物制备最佳条件的可靠性，根据响应面优化条件验证试验设计（表3）进行验证试验。从表4可以看出，大枣复合提取物的出汁率最高，因此大枣复合提取物酶解制备的最佳条件为酶添加量25.1 mg/L，酶解温度35.6 ℃，酶解时间1.8 h，出汁率达到81.03%。

2.3 卷烟加香评吸

对使用最优制备工艺得到的大枣复合香料进行加香试验，结果如表4所示。从表4可以看出，与空白样相比，大枣复合酶解提取物与卷烟烟草本香协调，增加卷烟甜润感，并可有效减少口腔刺激，减轻杂气，改善吸食卷烟时口腔的舒适感。当提取香料在烟丝中的添加量为0.3%时，香气细腻清雅，余味干净，口感舒适，且杂气和刺激性最小;当提取香料在烟丝中的添加量增至0.5%时，增加焦糖气，杂气和刺激性增大，因此大枣复合提取物的最佳添加量为0.3%。

3 结论

在烟用天然产物的提取过程中，由于提取物中含有较多的纤维素、果胶、半纤维素、色素等，在长期储藏过程中容易发生混浊，甚至发生沉淀，从而造成提取物性质不稳定，品质下降[19]。若使用酶解技术进行酶解，不仅可以提高出汁率，而且可以去除大部分易形成沉淀的成分，保持提取物在較长时间内的澄清状态，从而保持长期的稳定性[20]。

该研究以大枣为主要原料，用枸杞和苹果干进行复配，借助酶解技术提取大枣复合提取物，通过响应面优化提取工艺，并对提取物进行卷烟加香试验。结果表明，大枣复合香料的最佳提取条件：酶添加量25.1 mg/L，酶解温度35.6 ℃，酶解时间1.8 h，在此条件下复合提取物出汁率达到81.03%。按照响应面设计最佳提取条件，进行重复验证试验，实际得率为81.03%，与预测值相符。此外，卷烟加香试验表明，制得大枣复合酶解提取物作为一种烟用香料，具有增甜增润作用，能有效减小口腔刺激性，减轻杂气，改善余味，在“金圣”烟丝中的最佳添加量为0.3%。该制备方法工艺简单，设备要求低，在中式卷烟的开发与应用中具有良好的应用前景，为烟用香料的开发提供了新的思路。

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