水产养殖过程中嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性及耐药基因分析

陈总会 赵长臣 江小燕 孙承文 黄志斌 巩华

摘要 对养殖水体中的嗜水气单胞菌进行选择性分离，分析其对不同抗生素药物的敏感性。采用PCR方法对耐药株的耐药基因gyrA、qnrA和qnrS进行检测。结果表明，嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性最强，这与喹诺酮药物的过度使用密切相关。通过对耐药性嗜水气单胞菌和敏感性嗜水氣单胞菌的耐药基因扩增结果对比，发现耐药基因gyrA的检出率最高。该研究结果可为水产养殖过程中嗜水气单胞菌的耐药性检测及抗生素的合理使用提供分子生物学依据。

关键词 嗜水气单胞菌;喹诺酮药物;耐药基因;gyrA 基因

中图分类号 S94文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）17-0083-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.17.023

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract The selective isolation was conducted on Aeromonas hydrophila in aquaculture water  to analyze its sensitivity to different antibiotic drugs. The resistant genes gyrA，qnrA and qnrS were tested by PCR. The results showed that A.hydrophila was the most sensitive to quinolones，which was closely related to the excessive use of quinones. By comparing the amplification results of drugresistant genes in drugresistant A.hydrophila and susceptible A. hydrophila，it was found that the detection rate of drugresistant gene gyrA was the highest. The research results could provide molecular biology basis for the drugresistance detection of A.hydrophila and rational use of antibiotics in aquaculture.

Key words Aeromonas hydrophila;Quinolones;Drugresistant genes;gyrA gene

近年来，致病菌正逐渐成为水产养殖的重大危害，成为影响水产产品产量的重要因素。一般采用添加抗生素的方法减轻致病菌的危害。喹诺酮是一类广谱高效的抗菌药物，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较好的抑菌效果，因此喹诺酮药物被广泛应用于水产养殖行业。但由于喹诺酮药物在水产养殖行业中的滥用，许多病原菌对喹诺酮类药物已经产生不同程度的耐药性。因此十分有必要对鱼源病原菌的耐药性进行检测，以便于针对病原菌采用适当的抗生素药物，从而减少致病细菌对鱼类产品健康的危害。笔者首先对发病鱼的致病菌嗜水气单胞菌[1-6] 进行分离，然后对嗜水气单胞菌的药物敏感性进行测试。由于gyrA、qnrA和qnrS基因被认为是嗜水气单胞菌的主要耐药性基因[7-10]，采用PCR和琼脂糖凝胶电泳分析致病菌中喹诺酮药物抗性基因gyrA、qnrA和qnrS的表达水平，从而为科学水产养殖、合理使用抗生素提供分子生物学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。鱼类病原菌嗜水气单胞菌从广东韶关地区水产养殖基地发病的鱼中分离获得。该菌株的鉴定使用梅里埃Vitek-32全自动微生物分析鉴定仪以及全自动菌落计数仪。

1.1.2 试剂与仪器。细菌浊度计（WGZ-2，郑州南北仪器有限公司）;PCR仪（Master cycle，珠海黑马科技有限公司）;电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）;凝胶成像系统（GE公司）。高保真PCR mix购于广州擎科生物科技有限公司;Gold view 核酸染色剂、10×TAE均购于北京全氏金生物科技有限公司;琼脂糖购于invitrogen公司;质粒小量抽提试剂盒购于天根生化科技有限公司;柱式细菌基因组抽提试剂盒购于Umagen （美基生物科技有限公司，广州）。

1.2 方法

1.2.1 耐药表型检测方法。

采用临床实验室标准化委员会（CLSI）的纸片扩散法（NCCLS，2010年）测定分离菌的耐药特性，设置培养温度为30 ℃，每个培养皿加入药敏纸片，并设置3个平行。以大肠杆菌ATCC25922作为标准质控菌株，用游标卡尺测量抑菌圈直径。病原菌对每种氟喹诺酮类药物的耐药株百分比的计算公式：病原菌对药物的耐药株百分比=耐受菌数之和/总检测病原菌数[9]。

1.2.2 耐药基因扩增方法。致病菌模板DNA的制备采用液氮速冻煮沸法提取模板DNA。挑取纯化后的单菌落划线于TSA 平板，28 ℃下过夜培养，刮取适量菌苔置于含TE 的 灭菌离心管中，振荡混匀后99 ℃金属浴10 min，液氮速冻，重复2次，10 000 r/min 离心1 min，提取上清液作为PCR扩增的DNA 模板[10]。

1.2.3 PCR 扩增QRDR 靶基因。gyrA 基因的相应引物序列，由华大基因生物技术有限公司合成。gyrA 正向引物为CCATGAGCGTGATCGTAGGA，gyrA 反向引物为 CTTTGGCACGCACATAGACG。PCR 反应体系如下：2 ×Taq MasterMix 25 μL、10 μmol/mL 的上下游引物各2 μL、DNA 模板2 μL， 灭菌双蒸水补足50 μL。目标基因PCR 反应程序如下：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性3 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 个循环;72 ℃延伸5 min;以不加DNA模板的作为空白对照，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，使用GE公司的凝胶成像系统观察并拍照，根据目标产物亮度分析耐药基因的表达水平，并对所得PCR 产物进行测序鉴定[9]。

2 结果与分析

2.1 细菌药物敏感性

采用纸片琼脂扩散法分析了15株致病性嗜水气单胞菌对10种抗生素药物的敏感性，主要是喹诺酮类抗生素药物。其中9 株（60.0%）嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物产生耐药性，致病嗜水气单胞菌对萘啶酸的耐药率最高（50.0%），其次是氧氟沙星和诺氟沙星，耐药率分别为23.3%和18.9%;对环丙沙星的耐药率最低，仅7.7%。致病嗜水气单胞菌对头孢类药物呈现不同程度的耐药性，头孢噻吩的耐药率高达90%，而头孢噻肟和头孢曲松的耐药率分别为3.8%和4.2%，这可能与其使用频率有关。致病性嗜水气单胞菌对四环素和多西环素的耐药率较高，分别为35.5%和19.5%。致病性嗜水气单胞菌对青霉素类药物的耐药率较高，如氨苄西林的耐药率高达95.8%，可能由于其使用频率较高;致病性嗜水气单胞菌对氨基糖苷类药物的耐药性呈现较大差异，如对链霉素的耐药率约50%， 而对阿米卡星的耐药率只有5.4%（表1）。

2.2 喹诺酮基因的PCR 扩增

根据药物敏感性试验结果，对嗜水气单胞菌标准菌ATCC7966、1株喹诺酮类敏感菌株和6株喹诺酮药物耐药菌株采用PCR方法扩增耐药基因gyrA、qnrB和qnrS 基因， 耐药株经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统观察均呈阳性，6株菌中有4株扩增获得604 bp 左右的qnrB基因（图1A），4株均获得610 bp左右的qnrS 基因（图1B），6株菌全部扩增到620 bp左右的gyrA基因（图1C）。然而，标准菌及喹诺酮类敏感菌株未扩增得到目的基因[9]。

3 讨论

近年来，抗生素在水产行业的应用日趋广泛，通过抗生素的添加可以减少致病菌对水产品的危害，为养殖业减少了经济损失;但随着药物被长期、广泛地应用于水产养殖业中，耐药性细菌也日趋增加。耐药基因一旦被排泄到水产环境中，不仅会对养殖区域和周围的环境造成潜在的基因污染，而且还会通过各种可移动遗传元件（如质粒、转座子、整合子等）的水平遷移作用进入环境细菌甚至人体中，对人类的健康安全构成潜在的威胁。大量研究表明，在水产养殖过程中嗜水气单胞菌是一种重要的鱼类病原菌，嗜水气单胞菌的耐药性呈增长趋势，并且嗜水气单胞菌主要对喹诺酮药物的耐药性比较常见。为了减少耐药性嗜水气单胞菌对水产品甚至人体健康的危害，十分有必要对养殖水体中嗜水气单胞菌的耐药性及相关耐药基因进行监测，以便于对水产养殖过程中抗生素的使用进行合理规范的管理。

该研究中的药物敏感性试验结果表明，嗜水气单胞菌对喹诺酮药物的敏感性最强，这与喹酮药物的过度使用密切相关。通过对耐药性嗜水气单胞菌和敏感性嗜水气单胞菌的耐药基因扩增结果对比，发现耐药基因gyrA的检出率最高，说明该基因对嗜水气单胞菌的耐药性十分重要，是喹诺酮药物耐药性的关键基因。这与以前关于耐喹诺酮药物耐药基因的研究结果基本一致[7-10]。嗜水气单胞菌的gyrA基因编码DNA旋转酶，作用于喹诺酮药物，使其不能发挥药效，从而产生耐药性。该研究中关于水产养殖过程中嗜水气单胞菌药物敏感性及其耐药基因检测结果可为水产养殖过程中抗生素的合理使用提供理论依据，从而促进当地水产养殖业的良性发展。

参考文献

[1] 张翠娟，于宙亮，赵宝华，等.嗜水气单胞菌研究进展[J].中国兽药杂志，2008，42（7）：46-50.

[2] 陆承平.致病性嗜水气单胞菌及其所致鱼病综述[J].水产学报，1992，16（3）：282-288.

[3] 周碧君，李永明，温贵兰，等.斑点叉尾鮰致病性嗜水气单胞菌的分离[J].水产科学，2004，23（12）：9-12.

[4] 文正常，余波，徐景娥，等.患病大鲵中嗜水气单孢菌的分离鉴定及其防治[J].基因组学与应用生物学，2010，29（1）：82-86.

[5] 张玉芬，张秀军，张文丽，等.鲤鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学，2008，36（31）：13689-13690，13709.

[6] 王昱，袁增壮，聂福平，等.孟加拉进口黄鳝中致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定[J].安徽农业科学， 2013，41（24）：9997-9999，10026.

[7] 朱健铭，姜如金，吴康乐，等.从耐药产气肠杆菌中首次发现DNA旋转酶A亚单位基因gyrA新的变异型[J].中国微生态学杂志，2013，25（2）：139-142.

[8] 佟恒敏，刘芳萍，李昌文. 耐氟喹诺酮类鸡源性沙门氏菌DNA旋转酶gyrA基因序列分析[J].东北农业大学学报，2005，36（6）：767-773.

[9] 薛慧娟，邓玉婷，姜兰，等.水产动物源嗜水气单胞菌药物敏感性及QRDR 基因突变分析[J]. 广东农业科学，2012（23）：149-153.

[10] 崔佳佳.淡水鱼源嗜水气单胞菌耐药机制初探[D].上海：上海海洋大学，2016.