分子印迹光子晶体凝胶膜可视化检测葡萄酒中邻氨基苯甲酸甲酯

吴伟珍 黄梦霞 黄庆达 吕彩华 赖家平 孙慧

摘 要 ：邻氨基苯甲酸甲酯（Methylanthranilate， MA）是我国禁止在葡萄酒中添加的香料，对MA测定是葡萄酒中重要的质控环节。因此，开发快速检测葡萄酒中违禁香料的方法具有重要的实际意义。本研究利用分子印迹技术与光子晶体技术相结合，以MA为模板分子、甲基丙烯酸（MAA）为功能单体、甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）为交联剂，在60℃加热条件下引发聚合，去除光子晶体模板和洗脱印迹分子后得到反蛋白石结构分子印迹光子晶体凝胶膜。研究结果表明，此印迹凝胶膜对MA分子有较好的选择性，在分子识别过程中MA印迹凝胶膜的Bragg衍射峰位置随着MA浓度的增大而发生红移，达到平衡状态的时间为6 min，且偏移值（Δλ）与MA的浓度（C）在0.1～10.0 mmol/L范围内有良好的线性关系，检出限为31 μmol/L，可实现重复循环检测使用。此外，在检测不同浓度印迹分子时，肉眼能够观察到印迹凝胶膜颜色的变化。此智能型凝胶膜可望用于葡萄酒中MA的可视化快速检测。

关键词 ：分子印迹; 光子晶体; 可视化检测; 邻氨基苯甲酸甲酯

1 引 言

在葡萄酒生产中，有些不法商家为了追求利益，非法添加甜味剂、葡萄香精等违禁品。我国国家标准（GB150372006《葡萄酒》）已明确规定，任何葡萄酒产品都不能添加香精。葡萄香精主要由香料分子和助剂配制而成，其中香料分子主要是邻氨基苯羧酸酯类，如常见的邻氨基苯甲酸甲酯（MA）[1]。因此，对葡萄酒中香料分子的检测是葡萄酒的重要质控环节。

目前，关于葡萄酒中香料检测方法的报道不多，实际检测时仍主要靠感官品评的方法判断，准确性不高[2]，而标准的检测方法主要集中于色谱法[3]。虽然色谱检测结果准确可靠，适用范围广，但是也存在很多不足，如样品前处理过程复杂，所需仪器价格比较昂贵且笨重，不适于现场的快速检测，使用受限。基于此，开发方便快捷、灵敏专一的现场检测葡萄酒中香料的方法具有极其重要的意义。

光子晶体是具有不同介电常数（折射率）的介质在空间排列形成有序结构的材料，又称光子禁带材料，具有独特的光学性能，在光学传感领域应用广泛 [4～10]。分子印迹聚合物是一种对目标分子具有特异性识别的材料[113]。将分子印迹技术引进光子晶体传感材料中，可构建出既有光子晶体光学特性，又有分子印迹聚合物特异性识别能力的凝胶传感膜。这种凝胶传感膜在分子识别的过程中会引起光子带隙的位置移动，即无需信号转换原件即可将分子的识别过程直接通过光子晶体的光学信号表达出来，如偏移足够大，则能直接用肉眼观察到颜色的变化，从而达到可视化检测的目的。因此，这种传感材料在分析检测上具有一定的优势[4，15]。近年来，清华大学李广涛课题组将该材料成功应用于多巴胺、油酸的可视化检测[6，17]。随后，研究者还将该材料应用于环境内分泌干扰物[8，19]、氨基酸[20，21]、农药[22，23]、抗生素[24～28]、炸药分子[29]、金属离子[30，31]等的快速识别检测，证明了该类传感材料在分析检测中的可行性。目前，检测香料分子的分子印迹光子晶体凝胶传感膜的制备及应用尚未见报道。基于此，本研究以香料分子邻氨基苯甲酸甲酯為印迹分子，构建出一种智能型分子印迹光子晶体凝胶传感膜，用于葡萄酒中邻氨基苯甲酸甲酯的可视化快速检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

JSM7001F扫描电子显微镜（日本电子株式会社）; USB2500+光纤光谱仪（美国海洋光学）; H1850台式高速离心机（湖南湘仪仪器有限公司）; SHABA数显水浴恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）; XW80A涡旋混合器（上海精科实业有限公司）; KH300DE数控超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）; PHS3C型pH计（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）;  WS01恒温恒湿培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）。

对氨基苯甲酸甲酯、MA、对羟基苯甲酸甲酯（分析纯，麦克林试剂公司）; 甲基丙烯酸（MAA）、邻氨基苯甲酸（分析纯，阿拉丁试剂公司）; 偶氮二异丁腈（AIBN，分析纯，天津大茂化学试剂厂）; 甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA，分析纯，北京百灵威科技有限公司）; HF（45%，广州化学试剂厂）; H2O2（30%，广州化学试剂厂）; 其它试剂均为分析纯; 有机玻璃片（PMMA，购于当地厂家）。

2.2 实验方法

2.2.1 SiO2微球的合成及光子晶体模板的制备 SiO2微球的制备是根据经典的Stber法并稍做改进：在250 mL洁净干燥的锥形瓶中依次加入16 mL无水乙醇、25 mL去离子水和9 mL氨水，以1100 r/min磁力搅拌使溶液混合均匀，再迅速加入3 mL TEOS和45 mL无水乙醇组成的混合液，搅拌2 min后， 将搅拌速度调至400 r/min，室温下继续反应2 h。反应结束后得到乳白色悬浊液，以3500 r/min离心10 min， 得到SiO2微球，并用无水乙醇重复洗涤3～4次。将微球超声分散在无水乙醇中，得到SiO2微球分散液。

光子晶体的制备采用垂直沉降自组装的方法：取4 mL上述制得的SiO2微球分散液至7 mL西林瓶中，再将经过食人鱼羟基化处理后的干燥载玻片垂直插入西林瓶中，放置在温度30℃、湿度45%的恒温恒湿生化培养箱中，无水乙醇挥发干后，在载玻片的表面得到有序排列蛋白石结构的光子晶体模板。

2.2.2 MA分子印迹光子晶体凝胶（MIPHs）膜的制备及条件优化 将适量MA、MAA、EGDMA溶于甲醇中，超声混匀，避光静置过夜，进行预组装，使模板分子与功能单体之间充分形成氢键作用。加入5 mg引发剂AIBN，通氮气5 min。取两片干净的有机玻璃片分别覆盖在光子晶体模板表面并夹紧，类似三明治结构。取适量上述配制好的预聚液缓慢注入三明治结构的缝隙中，使其充满，在无氧的状态下，于60℃的水浴中热聚合反应4 h。反应结束后，将三明治结构的夹层浸泡在1% HF溶液中，使载玻片和有机玻璃片分离，再将脱落后的有机玻璃片浸泡在4% HF溶液约3 h，以充分除去有机玻璃片表面附着的SiO2，最终得到反蛋白石结构的凝胶膜。用一定体积比例的甲醇水醋酸洗脱液浸泡凝胶膜以洗脱模板分子，即得到MAMIPHs膜，制备过程如图1所示。在不加模板分子的情况下，采用相同的方法制备非印迹凝胶（NIPHs）膜。

2.2.3 MIPHs膜识别性能的考察 将MIPHs膜浸入含有一定浓度MA的20%甲醇溶液中进行吸附，吸附完成后，用微型光纤光谱仪记录MIPHs膜在吸附前后布拉格衍射峰的位置，根据其布拉格衍射峰的变化情况，考察MIPHs膜对模板分子的响应性能。

3 结果与讨论

3.1 SiO2微球及蛋白石结构光子晶体模板的表征

SiO2微球的粒径大小、均匀性、分散性等因素对制备光子晶体模板有较大影响，本研究采用改进的Stber法合成得到SiO2微球。由SiO2微球和光子晶体模板的SEM图（图2）可见，制备得到的SiO2微球单分散性好、粒径均一，且通过垂直沉降自组装法制备得到的光子晶体模板排列整齐，呈现出面心立方紧密堆积的蛋白石结构。

3.2 MIPHs膜制备条件的优化

本研究制备的MIPHs膜的分子识别原理为：模板分子MA与功能单体在溶剂中通过氢键作用、静电作用等相互作用形成复合物，在无氧、加热的环境中，复合物与交联剂在引发剂的作用下发生聚合反应，将模板分子洗脱后即得到相应的MA特异性识别位点，MA分子可通过该识别位点被选择性地重新吸附到MIPHs膜中。因此，溶剂、功能单体、交联剂等是MIPHs膜进行分子识别的重要影响因素。在MIPHs膜制备过程中，溶剂作为致孔剂，用量过多会造成印迹物结构的刚性强度降低，从而影响识别效果，而用量过少又会影响印迹物空腔结构的数量。同时，溶剂的极性对模板分子与功能单体之间氢键的形成也有一定的影响。因此，选择合适的溶剂是制备MIPHs膜的关键。如图3A所示，

当溶剂为0.2 mL甲醇时， MIPHs膜识别效果最好。MIPHs膜对模板分子的识别是否能够转化为可读的光学信号，取决于膜可逆的溶胀收缩状态，此特性与交联剂用量相关，交联剂用量过多，膜的刚性强度太大，难以发生溶胀收缩，而交联剂用量过少，膜的柔韧性太大，难以形成稳定的三维有序孔状结构，甚至失去光学信号。由图3B可知，当模板分子与交联剂的摩尔比为1∶1时印迹效果最佳。此外，分子印迹是通过功能单体与模板分子之间的氢键作用、静电作用等实现特异性化学键吸附，因此，选择合适功能单体将会提高印迹位点的数量、有效性、选择性等。本研究考察了甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酰胺（AM）、丙烯酸（AA）作为功能单体时的情况（图3C），當功能单体为0.5 mmol MAA时，印迹识别效果最好。在选定的最优条件下制备MIPHs膜，由图3D可知，制得的MIPHs膜具有高度有序的反蛋白石结构。

3.3 MIPHs膜对MA的响应时间

制备得到的MIPHs膜具有三维高度有序的 多孔结构，其中分布着丰富的特异性识别位点，在目标分子响应的过程中，引起光子晶体凝胶膜体积发生溶胀或收缩，在一定时间内达到平衡状态。基于此，将MIPHs膜插入到10 mmol/L MA的20% （V/V）甲醇溶液中进行吸附，实验结果如图4所示，当响应时间为6 min时，已基本达到吸附平衡状态。

3.4 MIPHs膜对MA的传感性能

为了研究MIPHs膜对MA的传感性能，将MIPHs膜浸泡在一系列不同浓度的MA溶液中进行吸附，测定吸附前后布拉格衍射峰的位置。如图5A所示，随着MA浓度增大，凝胶膜的布拉格衍射峰发生红移，这是因为MIPHs膜选择性吸附MA，在一定程度上也增大了离子强度，使MIPHs膜的晶格结构胀大，最终导致布拉格衍射峰发生红移。由图5B可知，布拉格衍射峰偏移值（Δλ）与MA分子的浓度在0.1～10.0 mmol/L范围内具有很良好的线性关系，可用于对MA的定量检测，检出限为31 μmol/L（S/N=3）。由图5C可见，检测不同浓度MA时，肉眼可观察到印迹凝胶膜颜色的变化，表明此智能型凝胶膜可用于MA的可视化快速检测。如图5D所示，当NIPHs膜浸泡在不同浓度的MA溶液进行吸附，NIPHs膜的布拉格衍射峰偏移量不大，这是由于NIPHs膜不具有印迹位点，这也进一步验证了MIPHs膜对MA具有特异性识别作用。

3.5 MIPHs膜的选择性

以结构相似的邻氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯为参照，考察了MIPHs膜对MA的特异性识别性能。如图6所示，MIPHs膜在对MA测定时较为灵敏，布拉格衍射峰移动明显，而测定结构类似的其它3种分子时，MIPHs膜的布拉格衍射峰移动不明显，表明制备的MIPHs膜对MA具有良好的选择性。

3.6 MIPHs膜的重复使用性性能

采用同一片MIPHs膜进行重复性实验，将MIPHs膜浸泡在10 mmol/L MA的20%甲醇溶液中，吸附平衡后，用光纤光谱仪进行检测，然后用洗脱液洗脱模板分子再进行吸附，如此重复10次，该MIPHs膜对MA均有较好的响应性（图7），表明本方法制备的MIPHs膜易于循环再生，重复使用性能良好，能够实现多次重复使用。

3.7 葡萄酒中MA含量的测定

为了验证本方法对实际样品的分析性能，采用本方法检测了国产蛇龙珠葡萄酒和赤霞珠葡萄酒，二者均未检出MA。将葡萄酒稀释5倍后，分别添加0.8、5.0 和8.0 mmol/L的MA，采用本方法检测，加标回收率在91%～101%之间（表1），表明本方法在葡萄酒质控中具有潜在的实用性。

4 结 论

将光子晶体技术与分子印迹技术结合，对制备条件进行优化，成功制备出具有反蛋白石结构的分子印迹光子晶体凝胶膜。此凝胶膜对目标分子MA具有良好的选择性，且可重复使用，可实现对目标分子的可视化半定量检测，具有快速、简便、可高效现场检测的优势。 本方法在葡萄酒质控中有良好的应用潜能。

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Abstract Methylanthranilate （MA） is a kind of spice illegally added in the wine in China. The determination of MA in wine is an important quality control link. Therefore， it is of great significance to develop a rapid method for detection of prohibited spice in wine. In this work， an inverse opal structural molecularly imprinted photonic hydrogels （MIPHs） membrane was fabricated by using the photonic crystal techniques and molecular imprinting techniques. The MIPHs membrane was prepared by using methylanthranilate as template molecule， methacrylic acid as functional monomer， ethylene glycol dimethacrylate as cross linker， followed by a thermal polymerization at 60℃. Then the inverse opal structural MIPHs membrane was obtained after removing photonic crystal template and imprinted molecules. The results showed that the MIPHs membrane exhibited a good selectivity property to MA， and it responded to MA within 6 min. The Bragg diffraction peak shifted with increasing concentration of MA. A linear relationship was found between Δλ and the concentration of MA in the range from 0.1 mmol/L to 10 mmol/L. And the least detectable concentration was about 31 μmol/L. Furthermore， a color change of the MIPHs membrane couldbe observed by naked eyes. Therefore， the smart MIPHs membrane showed great potential in rapid and visual detection of MA in wine.

Keywords Molecular imprinting; Photonic crystal; Visual detection; Methylanthranilate