正交试验优化加杨树皮中总酚酸的提取工艺

王 碧，严 奇，赵友谊，王 鸣，刘 飞，廖盼华，王奇志*

(1.江苏省中国科学院植物研究所江苏省植物资源研究与利用重点实验室，江苏南京210014；2. 江苏省中国科学院植物研究所江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京210014)

加拿大杨(PopuluscanadensisMoench)，又名加杨，是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)多年生落叶大乔木，分布广泛，我国除广东、云南、西藏外，其余省区均有栽培；枝叶茂密，树干高大通直，适应性强，能够在干旱和盐碱地栽培，是用材林、行道树和防护林的优良树种[1]。杨树周身是宝，除被用作木材外，还具有抗氧化、抗肿瘤、抗溃疡、抗微生物、抗炎、镇痛等功效[2-4]；其中含有大量的酚酸类化合物，能有效降低高血压、癌症和糖尿病的发生率。此外，杨树皮中还含有白杨素、高良姜素-3-甲氧基、乔松素、槲皮素-3,7-二甲氧基、鼠李素、山柰酚-3-甲氧基、芹菜素等黄酮类化合物[5]，对心血管系统、生殖系统、消化系统、内分泌系统、神经系统等均有作用[6]。白杨素具有抗肿瘤、放疗增敏、抑制芳香酶活性、抗炎、抗氧化、防治心脑血管疾病等多种药理作用[7]，也是合成抗菌、抗癌、降血糖、调节免疫等药物的原料[8-11]。

杨树皮化学成分的传统提取分离方法主要是用热水提取，或是水提液的乙酸乙酯萃取部位加入过量的碱式醋酸铅后，分为沉淀和水溶液两部分，沉淀脱铅后和水溶液分别用聚酰胺柱层析法或逆流分配法进行分离。然而，这些方法需用酸碱处理，环境污染大；其次，碱性环境易引起苯甲酰基转移；并且用与不用铅盐处理而分离得到的成分也大致相同。此外，杨树皮还含有丰富的低极性活性类脂类成分，如不饱和甾醇、维生素E、磷脂等[12]，具有很高的药用和经济价值，传统提取方法导致其低极性部位流失，资源得不到充分利用。因此，开发简便、准确、环保的经石油醚冷浸脱脂后的杨树皮总酚酸的提取方法具有重要意义。本实验以总酚酸的含量为指标，采用正交试验法筛选杨树皮总酚酸的最佳提取工艺，为加杨资源的进一步开发利用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 材料

加拿大杨树皮采自南京中山植物园，经江苏省中国科学院植物研究所袁昌齐研究员鉴定为杨柳科植物加拿大杨，粉碎成粗粉，备用。标本现存放于江苏省中国科学院植物研究所药用植物研究开发中心(标本编号：pc20161019)。

1.1.2 仪器

TU-1221型紫外-可见分光光度计；石英比色皿(1 cm)；R-210型旋转蒸发器(瑞士Buchi公司)；LIBROR AEL-200型电子天平；DK-98-II型电热恒温水浴锅。

1.1.3 试剂

白杨素对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号：111701-200501)；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 杨树皮总酚酸的提取

精密称取经石油醚冷浸脱脂后的杨树皮粉末1 g，三次分别加入4 mL，3 mL及3 mL的60%乙醇，浸泡30 min，加热回流3次，每次2 h，过滤，合并滤液，置10 mL量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度。精密吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加60%乙醇定容，过滤，取滤液，即得。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取白杨素对照品5.000 mg，置50 mL棕色量瓶中，加60%乙醇溶解并定容，得白杨素贮备液(0.1000 mg·mL-1)；精密量取白杨素贮备液适量，用60%乙醇配制成系列浓度的对照品溶液，即得。

1.2.3 紫外吸收波长的测定

取2 mL对照品于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，以无水乙醇为参比液进行基线校正，用紫外可见分光光度计在 200～800 nm 处扫描。

1.2.4 标准曲线的制备

分别吸取白杨素对照品溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，于500 nm 处测定吸光度。以白杨素的浓度(C)为横坐标，以吸光度(A)为纵坐标，得到标准曲线方程为：A=6.6706C+0.0078，R2=0.9993，结果表明，白杨素在0～0.1002 mg·mL-1范围内线性关系良好。

1.2.5 精密度试验

取对照品溶液适量，于500 nm波长处测定吸光度，重复测定5次，结果平均吸光度为0.342，RSD为0.29%。表明精密度良好。

1.2.6 稳定性试验

取供试品溶液适量，于500 nm波长处测定吸光度，每隔20 min测定一次，结果平均吸光度为0.349，RSD为1.42%。表明样品溶液显色后在60 min内稳定。

1.2.7 重复性试验

称取杨树皮粉末6份，按2.1.2项下供试品溶液的制备方法制备，根据紫外分光光度法，于500 nm波长处测定吸光度，结果供试品的平均含量为10.40 mg·g-1，RSD为1.82%。表明重复性试验良好。

1.2.8 加样回收率试验

取已知含量的杨树皮粉末6份，每份0.05 g，精密称取，精密加入白杨素贮备液5 mL，按1.2.2项下供试品溶液的制备方法制备，根据紫外分光光度法，于500 nm波长处测定吸光度，平行操作6份，结果平均回收率为100.95%，RSD为2.49%。

1.2.9 样品的测定

精密吸取正交试验样品1～3 mL，加入60%乙醇适当稀释，过滤，取滤液，即得供试品溶液。取供试品溶液适量，根据紫外分光光度法，于500 nm波长处测定吸光度，计算杨树皮总黄酮及酚酸的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 溶剂浓度的筛选

分别称取10份杨树皮粉末各10 g，置于圆底烧瓶瓶中，分别向其中加入20、30、40、50、60、70、80、90%的乙醇溶液100 mL，浸泡30 min，加热回流2 h，过滤，得样品提取液，按照1.2.9项下测定方法进行含量测定。结果显示，60%乙醇溶液的提取得率最高，故选择60%乙醇溶液作为提取溶剂，见表1。

表1 溶剂浓度的筛选Table 1 The selection of solvent concentration

2.1.2 回流次数的筛选

分别称取5份杨树皮粉末各10 g，分别加入60%乙醇溶液100 mL，采用回流法分别提取1、2、3、4、5次，每次2 h，过滤，得样品提取液，按照1.2.9项下测定方法进行含量测定。结果显示，在一定范围内，总酚酸得率与回流次数呈正相关；当回流次数达到3时，总酚酸得率与液料比无关，几乎为一定值。从节约能源的角度考虑，故选择回流次数为3，见表2。

表2 回流次数的筛选Table 2 The selection of reflux times

2.1.3 回流时间的筛选

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分别称取6份杨树皮粉末各10 g，分别加入60%乙醇溶液100 mL，采用回流法分别提取1、2、3、4、5 h，过滤，得样品提取液，按照1.2.9项下测定方法进行含量测定。结果显示，在一定范围内，总酚酸得率与回流时间呈正相关；当回流时间达到2 h时，总酚酸得率与液料比无关，几乎为一定值。从节约能源的角度考虑，故选择回流时间为2 h，见表3。

表3 回流时间的筛选Table 3 The selection of reflux time

2.1.4 液料比的筛选

分别称取2份杨树皮粉末各10 g，分别以料液比为3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1及30∶1的60%乙醇溶液回流提取，过滤，得样品提取液，按照1.2.9项下测定方法进行含量测定。结果显示，在一定范围内，总酚酸得率与液料比呈正相关；当液料比达到10∶1时，总酚酸得率与液料比无关，几乎为一定值。从节省溶剂角度考虑，故选择液料比为10:1，见表4。

表4 料液比的筛选Table 4 The selection ofthe liquid-solid ratio

2.2 正交试验设计

为全面考察影响因素，基于前期单因素试验结果，对影响提取效果的主要因素设计了4因素3水平的L9(34)正交试验，按照1.2.9项下测定方法进行含量测定，以白杨素提取率为指标，对最佳提取条件进行研究，正交试验因素与水平见表5、试验结果见表6、方差分析结果见表7。

表5 正交试验因素与水平Table 5 The factors oforthogonal experimental design

2.3 正交样品溶液的制备

分别称取杨树皮粉末10 g，按照L9(34)正交试验表提取样品，加相应提取溶媒定容至一定体积，即得正交样品溶液。

2.4正交试验方法及结果

用L9(34)正交试验表进行正交试验研究，试验结果见表6，并对总黄酮及酚酸的含量进行方差分析，结果见表7。

由表7能够直观地看出，以总酚酸含量为考察指标，影响含量的因素依次为A>D>B>C，即乙醇浓度的影响最高，其余依次是液料比、回流次数，影响最小的是回流提取时间。根据方差分析结果可知，A因素对提取的影响有显著性差异，B和D因素对提取的影响无显著性差异。根据表6各因素k的变化，A2>A3>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，D2>D3>D1，得出A、C和D因素应选择水平2，B因素应选择水平3，即A2B3C2D2。最终确定杨树皮总酚酸的最佳提取工艺条件为：A2B3C2D2，即使用60%乙醇回流提取3次，每次2 h，液料比为10∶1。

表6 正交试验结果及分析Table 6 The results andanalysis of orthogonal experimental design

表7 方差分析结果Table 7 The results ofanalysis of variance

2.5 最佳提取工艺条件的验证

按照上述最佳提取条件进行3次验证试验，其结果见表8。由验证结果可知，按最佳工艺条件提取得到的总酚酸提取率均高于其它各正交试验值，三份样品总酚酸的平均提取率为28.34%，RSD为1.37%。说明该工艺稳定、可靠，达到了提取条件优化的目的。

表8 验证试验结果Table 8 The results of verification tests

3 结论与讨论

3.1 本试验采用紫外分光光度法，在200～ 800 nm范围内对白杨素对照品溶液及供试品溶液进行扫描，于500 nm处测定吸光度，操作简单，干扰少，测定结果更准确。

3.2 杨树皮的主要成分是酚酸类化合物，以白杨素的含量为考察指标进行了L9(34)正交试验，确定了最佳提取工艺条件为：以60%乙醇为溶媒，提取3次，每次2 h，总液料比为10∶1。验证实验表明，该提取工艺稳定可行，适用于加拿大杨的工业化提取。

3.3 综上所述，对于经石油醚冷浸脱脂后的杨树皮有效成分的提取可采用较低浓度的乙醇在适当的温度和回流时间下进行提取，既避免了用甲醇提取以降低毒性，又提高了提取率。因此，本实验对于加拿大杨树皮有效成分的提取达到了工序短、易操作和成本低的目的，改进了加工工艺，为加拿大杨的工业化加工和生产提供了参考。