木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表达分析

丁泽红 吴春来 颜彦

摘要：海藻糖-6-磷酸酯酶（TPP）负责海藻糖生物合成催化反应的最后一步，是植物海藻糖生物合成途径的关键酶。采用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因，命名为MeTPP6，该基因含有1个1 122 bp的开放阅读框，编码373个氨基酸，具有TPP家族保守结构域。系统进化树分析表明，MeTPP6与杞柳和杨树中同源基因的亲缘关系较近，序列相似性高达89.7%和89.0%。启动子分析表明，MeTPP6含有干旱、低温、热胁迫、激素（如ABA）和光响应等相关元件。荧光定量PCR分析表明，MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低;在须根和储藏根中表达量最高，分别为叶片表达量的4.2倍和4.5倍。而且，MeTPP6基因的表达能被干旱、低温和ABA处理显著诱导。这些结果表明，MeTPP6通过依赖于ABA的信号通路在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫，可作为重要候选基因进一步研究其在木薯非生物逆境中的功能。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科熱带地区重要的薯类作物，具有高产、高淀粉和耐贫瘠等特性，在现代农业和工业中占有非常重要的地位。木薯是一种耐旱作物，一方面木薯可以通过调节气孔开闭以及新展开叶片的表面积大小来减少蒸腾作用造成的水分损失;另一方面，木薯具有发达的根系，可以从深层（>2 m）土壤中吸收水分[1]。然而，在较长时间或较为严重的干旱条件下，其块根产量仍会显著下降[2]。作为典型的热带作物，木薯主要种植在30°S至30°N之间的热带和亚热带地区。与其抗旱性相比，木薯对低温非常敏感，在<14 ℃时木薯生长比较缓慢，<10 ℃时木薯将停止生长。更严重的是，极端的低温气候可以造成木薯大幅减产甚至绝收[3]。因此，提高木薯对干旱和低温等胁迫的抗性，使其在不良生长环境下减少产量损失或是维持原有产量具有重要意义。

海藻糖是天然双糖中最稳定的糖质，在真菌、细菌、藻类、和动植物中广泛存在[4]。研究表明，在干旱、低温和高盐等非生物胁迫条件下，植物体内海藻糖含量会大量积累[5]，植物生物抗性显著增强。因此，提高海藻糖含量的累积对植物抵御干旱、低温等逆境胁迫非常重要。植物中海藻糖主要经TPS/TPP途径合成，即尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖分别在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，简称TPS）、海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，简称TPP）的催化作用下生成海藻糖[6]。不难看出，TPP负责海藻糖生物合成催化反应的最后一步，是植物海藻糖生物合成途径的1个关键酶。

植物中TPP由多基因编码，例如水稻中有13个TPP基因（OsTPP1-OsTPP13）[7]，拟南芥中有10个TPP基因（AtTPPA- AtTPPJ）[8-9]，它们都含有TPP基因家族保守结构域。早在2005年，Pramanik 等从水稻中克隆了OsTPP1基因，瞬时表达表明OsTPP1受到低温、干旱、盐和外源脱落酸（ABA）诱导，而且低温处理后同时提高了TPP活性和海藻糖含量[10]。将OsTPP1基因在水稻中超表达后，转基因植株对盐和低温的耐受性增强[7]。进一步功能分析表明，OsTPP1可以激活胁迫相关基因的表达，从而增强转基因植株的抗逆性[7]。重要的是，Nuccio等将OsTPP1基因在玉米中超表达后，多年份多地点田间试验表明，转基因植株在正常和干旱条件下均可以增加玉米产量[11]。由此可见，OsTPP1是1个重要的作物抗逆遗传改良的候选基因。另1个水稻TPP基因OsTPP7，最近被证明通过糖代谢调控增强水稻厌氧萌发的耐受性[12]。在拟南芥中，Vogel等通过酵母互补试验鉴定并克隆了2个拟南芥TPP基因AtTPPA和AtTPPB[13]。研究发现，AtTPPA和AtTPPB表达后可以互补tps2突变体的功能，并能够在体内（in vivo）和体外（in vitro）试验中检测到TPP活性[13]。此外，拟南芥TPP基因家族成员的表达也受到低温、干旱、盐和ABA处理的调控[9]。

然而，目前这些研究主要集中在模式植物拟南芥和水稻中，在热带作物（如木薯）中尚没有关于TPP基因克隆及其响应非生物胁迫的研究报道。本研究采用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因（命名为MeTPP6），分析其保守结构域、系统进化树和启动子元件，并通过qRT-PCR分析了其在不同组织中以及在干旱、低温和外源ABA处理下的表达水平，旨在为进一步研究MeTPP6在木薯非生物逆境响应中的功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料为木薯主推栽培品种Ku50，具有高淀粉、抗逆性好等特点，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。植物RNA提取试剂盒（货号：DP437）购自天根生化科技有限公司，cDNA反转录试剂盒（货号：K1622）购自Fermentas 公司。本研究中PCR引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 木薯种植与处理

按照丁泽红等方法[14]进行木薯种植。将Ku50种茎切成15 cm左右的茎段，选择粗细均匀且含有3～4个芽眼的茎段种植于塑料盆（上直径18.5 cm，下直径14.8 cm，高18.8 cm），每盆种植1个茎段。将蛭石和营养土按照1 ∶ 1的体积比混合后作为木薯基质。种植约10 d后对木薯进行间苗，每盆只保留1棵苗。试验时间为2013年5月，试验地点为中国热带农业科学院热带生物技术研究所。木薯种植60 d后，分别进行低温、干旱和ABA处理。（1）低温处理：将生长状况一致的植株放置于光照培养箱，进行4 ℃低温胁迫处理。在处理0、6、24 h 后，分别收集第1张完全展开叶、未展开叶和根的样品，-80 ℃保存备用。（2）干旱处理：采用PEG-6000进行干旱模拟处理。处理植株浇灌20%的PEG-6000溶液，对照植株不施PEG（采用浇灌自来水代替）。在处理0、3和24 h 后，分别收集第1张完全展开叶、未展开叶、老叶和根的样品，-80 ℃保存备用。（3）ABA处理：采用 100 μmol/L ABA溶液进行浇灌处理，在处理0、3、5、7 d 后收集第1张完全展开叶的样品，-80 ℃保存备用。

为了研究不同组织中MeTPP6基因的表达情况，还收集了正常种植条件下木薯Ku50的根（包括须根和储藏根）、茎、叶和叶柄的样本，用于qRT-PCR分析。

1.3 引物合成及qRT-PCR

1.4 生物信息学分析

参照丁泽红等方法[14]进行生物信息学分析，具体描述如下：用BLASTP搜索Phytozome数据库，获取其他物种中与MeTPP6同源的蛋白质序列;用ExPASy ProtParam计算蛋白质的等电点和分子量;用Plant-mPLoc预测亚细胞定位;用NCBI-CDD数据库预测保守结构域;用ClustalX进行序列比对;用MEGA 5.2构建Neighbor-Joining系统进化树;用PlantCARE分析启动子元件;用Primer 5.0软件设计PCR引物。

2 结果与分析

2.1 MeTPP6基因克隆

在前期木薯转录组数据中获得了1个在干旱胁迫下差异表达基因（cassava4.1_009931m.g），之后根据Phytozome木薯数据库提供的参考序列，设计引物进行PCR扩增、凝胶电泳检测（图1）。经测序后获得1条全长为1 122 bp的序列，编码373个氨基酸（图2），根据其与水稻TPP基因的同源性将其命名为MeTPP6。序列比对发现，MeTPP6与参考序列之间仅存在1个碱基差异，可引起氨基酸编码的改变。ProtParam预测MeTPP6蛋白的分子式为C1 876H2 988N510O544S14，总原子数目为5 932，理论等电点（pI值）为9.31，分子量为 41 840.3 ku，不稳定系数为27.48，属于稳定蛋白。亚细胞定位预测该蛋白质定位于液泡或叶绿体。NCBI-CDD保守结构域分析表明，MeTPP6编码的蛋白含有TPP基因家族保守结构域（Trehalose_PPase）（图2），属于木薯TPP基因家族成员。

2.2 MeTPP6系统进化树分析

通过BlastP工具在线搜索Phytozome数据库获取与MeTPP6同源性较高的其他物种中的蛋白质序列，构建系统进化树。聚类后发现，这些基因可以分为3组（图3）：第Ⅰ组包括许多C4植物，如小米、狗尾草、黍羊Panicum hallii、柳枝稷、玉米、高粱和二穗短柄草;水稻TPP基因也被聚类在第Ⅰ组，它与二穗短柄草的同源基因亲缘关系较近，序列相似度高达87.8%。木薯MeTPP6基因被聚类在第Ⅱ组，它与杞柳（SapurV1A.0684s0130.1）和杨树（Potri.005G077200.1）中同源基因的亲缘关系较近，序列相似性分别为89.7%和89.0%。拟南芥TPP基因被聚类在第Ⅲ组，同时还包含了其他十字花科的物种，如白菜型油菜、荠菜花、琴叶拟南芥和鼠耳芥等。

2.3 MeTPP6基因启动子分析

启动子对基因表达起重要调控作用，它决定着基因的转录起始和表达程度。本研究选取MeTPP6起始密码子上游 1 500 bp 的序列进行启动子分析，发现了许多与逆境响应相关的元件，如干旱诱导元件MBS、低温响应元件LTR、低温和干旱响应元件C-repeat/DRE、热胁迫响应元件HSE以及防御与胁迫相关元件TC-rich repeats（表1）。除此之外，还发现了许多与激素响应相关的元件，如水杨酸响应元件TCA-element、茉莉酸响应元件TGACG-motif和CGTCA-motif、赤霉素响应元件P-box和GARE-motif、脱落酸（ABA）响应元件ABRE，以及许多与光响应相关的元件，包括MRE、ACE、G-Box、Sp1和box II等。这些研究结果表明，MeTPP6可能参与木薯干旱、低温、高温、激素和光响应相关的基因表达调控。

2.4 MeTPP6在木薯不同组织中的表达分析

TPS基因的表达量在植物不同组织器官中存在较大差异。本研究考察了MeTPP6基因在木薯Ku50不同组织中的表达情况，结果表明，MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低;茎中表达量较高，约为叶片中表达量的2.1倍;须根和储藏根中表达量最高，分别为叶片中表达量的4.2倍和4.5倍（图4）。这些结果表明，MeTPP6基因主要在木薯的须根和储藏根中起作用。

2.5 MeTPP6在不同胁迫条件下的表达分析

本研究在MeTPP6基因启动子区域发现了干旱、低温和ABA响应相关的元件。为了进一步验证MeTPP6的功能，本研究分别在干旱、低温和ABA处理条件下考察了MeTPP6基因的表达模式（图5）。

在PEG-6000胁迫条件（模拟干旱）下，在处理3、24 h后MeTPP6在老叶中的表达量呈现持续下降的变化趋势，但表达量无显著差异;在第1张完全展开叶中，MeTPP6的表达量呈现先下降后上升的变化趋势，在处理3、24 h后分别下降了19%和上升了1.3倍;在未展开叶，MeTPP6的表达量呈现先不变后上升的变化趋势，在处理24 h后上升了1.8倍;在根中，MeTPP6的表达量呈现持续上升的变化趋势，在处理3、24 h后分别上升了1.3倍和1.5倍（图5-A）。

在低温胁迫下，在未展开叶和第1张完全展开叶，MeTPP6的表达量在处理6、24 h后均呈现持续下降的变化趋势，其表达量分别下降了56%和64%、49%和65%;不同的是，根中MeTPP6的表达量在处理6、24 h后呈现持续上升的变化趋势，其表达量分别上升了3.8倍和8.1倍（图5-B）。

在ABA处理条件下，MeTPP6在叶片中的表达量显著上升了，在处理3、5、7 d后分别上升了1.4倍、1.7倍、1.9倍（图5-C）。

这些结果充分表明，MeTPP6基因在转录水平参与干旱、低温和ABA處理响应，可作为候选基因进一步研究其在木薯抗逆中的功能。

3 讨论与结论

海藻糖是重要的渗透调节物质，提高植物体内海藻糖含量可以增强植物对干旱、低温等非生物胁迫的抗性[16]。TPS和TPP是海藻糖生物合成途径中的关键酶。与TPS相比，有关植物TPP基因克隆的研究还很少，且大多数报道都集中在模式植物拟南芥和水稻中。拟南芥中共有10个TPP基因，水稻中有13个TPP基因，它们都含有TPP基因家族保守结构域[7-8]。研究表明，提高TPP基因的表达量可以增强植物对逆境胁迫的抗性。在拟南芥中超表达AtPPD基因后，转基因植株抗盐能力增强[17];在水稻中超表达OsTPP1基因后，转基因植株中OsTPP1表达量上升，其对低温、盐和干旱胁迫的抗性增强[7，10]。进一步试验表明，ABA代谢参与OsTPP1基因的表达调控[10]。而且，在玉米中超表达OsTPP1基因后发现，在正常和干旱条件下均可以增加玉米产量[11]。可见，TPP是1个非常重要的抗逆候选基因，可用于作物抗逆遗传改良育种。本研究通过RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因MeTPP6，序列分析表明MeTPP6编码373个氨基酸，含有TPP基因家族保守结构域，属于木薯TPP基因家族成员。进化树分析表明，它与杞柳和杨树中TPP基因的亲缘关系较近，序列相似性分别为89.7%和89.0%。

TPP基因在不同组织中的表达具有较大差异。例如拟南芥AtTPPA、AtTPPF和AtTPPG主要在花粉表达，AtTPPB主要在胚根、侧根以及根的伸长区表达，而AtTPPE主要在子叶和木质部表达[9]，暗示不同TPP成员可能倾向于在不同组织中发挥功能。本研究发现MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低，在须根和储藏根中表达量最高，支持MeTPP6基因主要在木薯的须根和储藏根中起作用。

TPP基因表达受到低温、干旱、盐、机械损伤和渗透胁迫等调控，且不同TPP成员对各种处理的响应不一样。例如，在拟南芥幼苗中，AtTPPE、AtTPPF、AtTPPG和AtTPPJ的表达均受到低温、盐和渗透胁迫的诱导，AtTPPA和AtTPPH的表达仅受到低温胁迫诱导但被盐和渗透胁迫抑制[9]。在根中，AtTPPD、AtTPPF和AtTPPI的表達均受到低温、盐和渗透胁迫的诱导;AtTPPA、AtTPPE和AtTPPG的表达受到低温和盐胁迫的诱导，但对渗透胁迫表现出不同的响应模式;而AtTPPB和AtTPPH的表达则受到低温、盐和渗透胁迫的抑制[9]。此外，不同TPP成员对激素的响应也不一样。AtTPPA和AtTPPB的表达受到ABA处理抑制，AtTPPI和AtTPPD的表达受到ABA处理诱导，而AtTPPE、AtTPPG和AtTPPF的表达则同时受到ABA和JA处理诱导[9]。水稻中OsTPP1基因的表达也受到低温、干旱、盐和外源ABA激素的诱导[7，10]。本研究在MeTPP6启动子区域发现了一系列与干旱、低温、防御和胁迫响应相关的元件，表达分析也进一步证实，MeTPP6基因的表达量受到干旱和低温的调控。植物响应外界非生物胁迫的信号路径主要分为依赖于ABA信号通路和不依赖于ABA信号通路2种[18]。本研究在MeTPP6启动子区域多个位置发现了与ABA响应相关的元件ABRE，且表达分析结果也表明MeTPP6基因表达是响应ABA信号的。因此，本研究推测MeTPP6可能是通过依赖于ABA的信号通路参与木薯干旱和低温等非生物胁迫调控。这些结果将为进一步研究MeTPP6基因在木薯抗逆中的功能提供理论参考。

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