氰氟草酯对泥鳅的毒性效应

尚泰宇，时春雨，秦朝辉，彭梦圆，贾博爽，夏晓华

(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)

稻田养鱼亦即嵌套养殖，是一种人工稻鱼共存的生态产业结构[1]。该农业生产模式将养殖业与种植业结合起来，因其高效便捷、经济双收等特点受到越来越多养殖户的青睐。小型淡水鱼类泥鳅(Misgurnusanguillicadatus)隶属鲤形目、鳅科、泥鳅属。其食性较广，是稻田生态渔业的优良养殖品种。同时，其具有环境适应力强、耐受性强等特点，是理想的水生生物试验材料。

氰氟草酯(Cyhalofop-butyl)作为一种对水稻具有高度安全性的芳氧苯氧丙酸类除草剂，在田间主要用于防除千金子等恶性禾本科杂草，近年来在农业生产中的使用呈逐步上升趋势[2]。农业生产中化学除草剂的不合理使用，易导致其通过地表径流、污水排放等方式流入河流、湖泊等水生生态系统，通过食物链富集，进一步对水生生物的生存及人体健康构成威胁。近年来，已有关于氰氟草酯对两栖类生物毒性分级、斑马鱼胚胎发育等水生生物影响的报道。吴长兴等[3]研究了氰氟草酯对泽蛙蝌蚪的急性毒性，结果显示，其对泽蛙蝌蚪的24 h半数致死质量浓度(LC50)和48 h LC50分别为0.718 mg/L和0.677 mg/L，属高毒级，田间施用应合理控制剂量；CAO等[4]研究了氰氟草酯对斑马鱼早期胚胎发育的毒性效应，结果表明，0.8 mg/L或更高质量浓度的氰氟草酯溶液对于早期胚胎发育具有更明显的致死效应，同时氰氟草酯在斑马鱼胚胎发育的不同阶段均产生较严重的负面影响。

目前，关于氰氟草酯对泥鳅的毒性研究尚未见报道。为此，以泥鳅为受试对象，探究了氰氟草酯对泥鳅肝脏的急性毒性、生理毒性及组织形态学毒性，旨在为安全施用氰氟草酯、促进农业特色生产结构水稻-泥鳅嵌套养殖可持续发展、维护生态平衡提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 供试动物及试剂

泥鳅(Misgurnusanguillicadatus)采自新乡市海鸿农贸市场，选择发育状况良好、体质量13～16 g、平均体长9～12 cm的健壮泥鳅500尾，试验前用曝气3 d的自来水驯养7 d，驯养期间死亡率小于2%。挑选健康、体表无损的个体作为试验材料；试验前进行饥饿处理，试验期间不投食，采用曝气2 d以上的自来水，水温13～24 ℃，溶解氧5～6 mg/L，pH值6.8～7.3。氰氟草酯购自上海惠光化学有限公司(有效成分质量浓度100 g/L)。

1.2 试验方法

1.2.1 氰氟草酯对泥鳅的急性毒性试验 根据预试验结果，等比设置5个试验组和1个空白对照组进行急性毒性试验，氰氟草酯质量浓度分别为6.00、6.30、6.62、6.95、7.29、0 mg/L，每组均投放健康泥鳅30尾，分为3个平行。每24 h更换一次等体积等质量浓度的氰氟草酯，试验开始后12 h连续观察，记录泥鳅24、48、72、96 h的中毒症状和死亡数量，及时清除死亡个体。最后，采用改良寇氏法[5-6]计算氰氟草酯对泥鳅的半数致死质量浓度和安全质量浓度(SC)。

1.2.2 氰氟草酯对泥鳅抗氧化系统酶活性的影响测定 在急性毒性试验的基础上，按照氰氟草酯处理96 h对泥鳅LC50的1/10、1/5分别设置低质量浓度试验组(0.662 4 mg/L)、高质量浓度试验组(1.324 8 mg/L)及1个空白对照组(0 mg/L)，每组均投放44尾健康泥鳅，每天更换一次等体积等质量浓度的氰氟草酯。分别于第1、3、5、7天从每组随机取5尾泥鳅，取其肝脏，在试验过程中，首先称量泥鳅肝脏的质量，然后以1∶9的比例加入0.8%生理盐水进行研磨直至无明显的组织块，SOD、CAT、GSH-Px活性的测定均按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行，采用BCA法测定泥鳅肝脏蛋白质含量。

1.2.3 氰氟草酯对泥鳅抗氧化系统相关基因表达的影响测定 处理组和取材天数同上，从每组随机取3尾泥鳅，取其肝脏保存于液氮。首先进行总RNA的提取，1%琼脂糖凝胶电泳检验总RNA完整性，超微量分光光度计检测RNA的纯度和质量浓度。使用全氏金RNA提取试剂盒构建20 μL反转录体系，其中包括Anchored Oligo(dT)181 μL、2×ES Reaction Mix 10 μL、EasyScript RT/R1 Enzyme Mix 1 μL、mRNA/总RNA 500 ng/μg，添加RNase-free Water至20 μL。反转录条件:42 ℃孵育30 min，85 ℃加热5 s失活EasyScript RT/R1，4 ℃保温，将RNA反转录成cDNA。取cDNA 0.5 μL为模板，相应基因正向和反向引物(表1)各0.2 μL，含有SYBR Green Ⅰ荧光染料、dNTPs、PCR增强剂、PCR稳定剂的混合物5 μL和ddH2O 4.1 μL构建10 μL实时荧光定量PCR(qPCR)反应体系，重复6组。qPCR扩增的参数如下：95 ℃预变性60 s；95 ℃变性15 s 和60 ℃复性60 s共进行45个循环；之后95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s、37 ℃保温30 s。测定出各个基因的Ct值，根据2-△△Ct法计算相关基因表达量。

表1 定量PCR引物信息

1.2.4 氰氟草酯对泥鳅的组织形态学毒性试验 处理和取材时间同酶活性测定，从每组随机取3尾泥鳅，取其肝脏进行石蜡切片HE染色。试验前配制铬矾明胶，清洗玻片，熬融石蜡。取泥鳅肝脏于4%多聚甲醛中固定24 h，流水冲洗后依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡试验步骤，最后用牛皮盒纸进行包埋。完成包埋的组织依次进行切片、展片、烤片、二甲苯浸泡、梯度酒精复水处理，最后对石蜡切片进行苏木精-伊红染色，显微镜观察其组织形态学变化。

1.3 数据处理

肝脏组织酶活性和基因表达试验数据均采用Excel 2010软件进行处理和分析，用SPSS 16.0软件进行差异显著性分析，P<0.05为差异达到显著水平，P<0.01为差异达到极显著水平。

2 结果与分析

2.1 氰氟草酯对泥鳅的急性毒性

泥鳅刚染毒时，表现为急剧游动、四处乱窜，片刻后稍趋于平静，伏于水底。随着氰氟草酯剂量的增加，可观察到泥鳅反应迟钝、身体弯曲、丧失平衡能力等现象，其死亡率不断升高，死亡时身体僵直，脊椎略弯曲呈弓形。

由表2可知，氰氟草酯对泥鳅24、48、72、96 h的LC50分别为7.254 4、7.102 3、6.809 3、6.623 7 mg/L，SC为2.042 3 mg/L。在同一时间段内，泥鳅死亡率随氰氟草酯质量浓度的升高而增加；在同一剂量组中，泥鳅死亡率随暴露时间的延长而增加。可见，泥鳅的死亡率与氰氟草酯呈时间-剂量效应关系。

表2 氰氟草酯各质量浓度组泥鳅的死亡率、半数致死质量浓度和安全质量浓度

2.2 氰氟草酯对泥鳅肝脏SOD、CAT和GSH-Px活性的影响

由图1可知，从相同质量浓度不同暴露时间来看，在低质量浓度组，泥鳅肝脏SOD活性在第3天升高后无显著性变化(P>0.05)，高质量浓度组SOD活性在第5天下降后无显著性变化(P>0.05)，且试验组SOD活性均显著高于对照组(P<0.05)。随着染毒时间的延长，试验组中CAT活性逐渐下降，且高质量浓度组较低质量浓度组变化更显著。GSH-Px活性呈现先上升后下降的变化趋势，低质量浓度组中GSH-Px活性在第5天达最大值，高质量浓度组中GSH-Px活性在第3天达最大值。

从相同暴露时间不同质量浓度组来看，在第1、3天，SOD活性随氰氟草酯质量浓度的增大而升高，在第5、7天，SOD活性先升高后降低，处理组均显著高于对照组(P<0.05)。在第1天，CAT活性随氰氟草酯质量浓度的增大而升高，而在第3、5、7天均呈现先升高后降低的趋势，至第7天时处理组与对照组无显著差异。在第1、3天，GSH-Px活性随氰氟草酯质量浓度的增大而升高，在第5、7天呈现先升高后降低的趋势。

不同小写字母表示同一剂量组不同暴露时间点之间存在显著性差异(P<0.05)，不同大写字母表示同一暴露时间点不同剂量组之间存在显著性差异(P<0.05)，下同

2.3 氰氟草酯对泥鳅肝脏SOD、CAT、GSH-Px基因表达的影响

由图2可知，从相同质量浓度不同暴露时间来看，在低质量浓度组中，SOD和CAT基因表达量随暴露时间的延长而呈上升趋势，GSH-Px基因表达量呈现先上升后下降趋势。高质量浓度组中，SOD和CAT基因表达量随暴露时间的延长呈现先上升后下降趋势，GSH-Px基因表达量呈现下降趋势。

从相同暴露时间不同质量浓度组来看，随着氰氟草酯质量浓度的升高，在第1、3天，SOD基因表达量呈现逐渐下降趋势，而在第5、7天呈现先上升后下降趋势；在第1天，CAT基因表达量呈现先下降后上升趋势，在第3、5、7天均呈先上升后下降趋势；在第1天，GSH-Px基因表达量呈现逐渐上升趋势，在第3、5、7天则呈现先上升后下降趋势，同时在低质量浓度组及高质量浓度组的基因表达量均显著高于对照组(P<0.05)。

图2 不同质量浓度氰氟草酯处理泥鳅肝脏中SOD、CAT、GSH-Px基因表达变化Fig.2 Expression changes of SOD, CAT and GSH-Px genes in Misgurnus anguillicaudatus liver treated with cyhalofop-butyl at different concentrations

2.4 氰氟草酯对泥鳅肝脏组织形态的影响

由图3可知，空白对照组(0 mg/L)中，泥鳅的肝脏细胞胞质均匀，细胞核均位于细胞中央，呈规则圆形或椭圆形，肝脏细胞形态规则且无明显变化。在低质量浓度试验组(0.662 4 mg/L)中，5 d时可见细胞间隙变大，7 d时可见细胞空泡化与细胞肿大现象。在高质量浓度试验组(1.324 8 mg/L)中，1 d时即可见肝脏细胞空泡化、细胞间隙增大现象，随着染毒时间的延长，细胞肿大、空泡化情况严重；7 d时肝脏细胞排列弥散，出现大量肝脏细胞空泡，同时伴有细胞溶解及核变形现象，核固缩情况严重。结果表明，随染毒天数和试验组质量浓度的增加，氰氟草酯对泥鳅肝脏组织损伤程度加深。

CS:细胞间隙;CV:细胞空泡;CE:细胞肿大;CP:细胞核固缩

3 结论与讨论

3.1 氰氟草酯的毒性分类

根据中国《化学农药环境安全评价试验准则》，当农药对鱼类1.0 mg/L<96 h LC50≤10 mg/L时，该农药属中毒[7]。由试验结果可知，氰氟草酯对泥鳅的96 h LC50为6.623 7 mg/L，说明氰氟草酯对泥鳅属于中毒。同时随着染毒时间的延长，泥鳅死亡率逐渐升高，表明氰氟草酯对水生生物有毒害作用。因此，在使用该除草剂时应注意合理使用，避免污染水源、破坏环境，以免对水生生物造成危害。

3.2 氰氟草酯对泥鳅肝脏抗氧化系统的影响

生物体肝脏在代谢有毒物质时会产生大量的活性氧，如超氧自由基、过氧化氢等。这些活性氧会破坏生物体内的蛋白质、DNA碱基、脂膜等物质，从而造成生物体的损伤甚至死亡。抗氧化酶系统的主要作用是平衡生物体内活性氧，避免其对生物体的氧化损伤[8]。已有研究表明，SOD、CAT、GSH-Px是生物防御体系的关键酶[9]。SOD能将生物体内过多的超氧阴离子转化为H2O2和H2O，降低其毒性[10]。CAT能催化H2O2分解成H2O和O2，从而使细胞免受H2O2的毒害。GSH-Px能特异性催化GSH对脂质氢过氧化物的还原作用，保护细胞免受氧化损伤。由于抗氧化酶对氧化胁迫敏感，故常作为研究机体是否处于氧化胁迫状态的生物指标。

本试验中，在氰氟草酯低质量浓度处理组中，泥鳅肝脏中SOD基因表达量呈上升趋势，酶活性则呈先升高后降低趋势；在高质量浓度处理组中，SOD基因表达量呈先上升后下降趋势，酶活性呈降低趋势，推测高质量浓度的氰氟草酯对SOD及其相关基因的影响呈先诱导后抑制作用。低质量浓度处理组中，CAT基因表达量呈上升趋势；在高质量浓度处理组中，CAT基因表达量呈先上升后下降趋势，可知高质量浓度组中，细胞受到氧化胁迫较为严重；在各质量浓度处理组中，CAT活性均呈下降趋势，与张静静[11]有关甲氰菊酯对泥鳅肝脏CAT的毒性作用试验结论一致。GSH-Px基因表达量及酶活性在低质量浓度组中均呈先升高后降低的趋势，在高质量浓度组中，基因表达量呈下降趋势，酶活性呈先升高后降低趋势，推测氰氟草酯对GSH-Px基因的影响也呈先诱导后抑制作用。由以上结果推测，低质量浓度的氰氟草酯能够在短时间内对泥鳅抗氧化酶系统的表达起诱导作用，这有助于机体快速代谢有毒物质；而随着暴露时间的延长和氰氟草酯剂量的增加，泥鳅肝脏组织发生病变，抗氧化酶系统持续受损，进一步导致酶活及相关基因表达受到抑制。

3.3 氰氟草酯对泥鳅肝脏组织的损伤

鱼类肝脏组织细胞的结构变化通常可以作为环境中有毒污染物的生物指标[12]。研究报道，当鱼类暴露于污染物中，会诱导产生肝脏细胞核裸露、胞质空泡化现象，同时伴随肝脏巨噬细胞增多、肝脏窦间隙增大等现象[13]。由于窦间隙的增大，肝脏细胞与血液间物质交换发生变化，造成大量液体滞留而导致肝脏组织易发生水肿[14-15]。在本试验中，低质量浓度氰氟草酯处理泥鳅第5天时可见肝脏窦间隙变大，第7天时开始出现肝脏细胞空泡化及肝脏组织水肿现象，与之前研究报道相一致。高质量浓度组中第7天可观察到肝脏细胞空泡化、细胞肿大情况十分严重，并伴有核固缩现象，推测DNA停止转录，这是细胞凋亡的典型形态特征之一[16]，说明氰氟草酯不仅使泥鳅的肝脏组织结构发生变化，还会导致肝脏细胞凋亡。

氰氟草酯对泥鳅有一定的急性毒性、生理毒性和组织损伤作用，因此在稻田施用时一定要控制其用量，防止水体污染，以减少对生态环境和稻田中的水生生物的危害，避免造成农户经济损失。合理施用农药是农业生产中的关键，对环境保护和农业的可持续发展具有重要的指导意义。