鸡堆型艾美耳球虫早熟株免疫效力分析及安全性评价

康慧鑫，王 丽，郑明学，白 瑞，张 黎，张雪松，李瑞琪，郝思源，白 冰

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

鸡球虫病是专性寄生于家禽肠道上皮细胞内的一种寄生虫病，诱发鸡只肠炎并伴有腹泻，因其多发、危害严重、防治困难，造成了巨大的经济损失[1-3]。在已知的9 种鸡球虫中，堆型艾美耳球虫流行率最高，分布广泛，致病性较强，养殖中以混合感染常见[4-5]。

目前鸡球虫病仍以药物防治为主，但虫株的耐药性以及因药残而引起的食品安全问题[6-9]日趋严重。在治疗传染病时，最有效的方法之一就是接种疫苗以诱导保护性免疫[10]，疫苗免疫具有无残留、效果确实、一次免疫终生保护等优点[11]。目前，商用的鸡球虫病疫苗有强毒活疫苗和弱毒活疫苗，由球虫亲本株制备的强毒活疫苗虽免疫效果良好，但因其致病力强、安全性差，易引起球虫病暴发；而由球虫亲本株选育出的早熟弱毒球虫疫苗因其安全性高、免疫效果好，得到广泛推广应用[12-14]，故早熟选育弱毒株仍是鸡球虫病疫苗的主要研究方向。

山西农业大学动物科技学院兽医病理实验室已获得免疫原性良好、遗传稳定[15]的鸡堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）早熟株，其二次免疫的最小免疫剂量为首免1 羽份（400 个/羽），二免2 羽份（800 个/羽）[16]。作为弱毒疫苗虫株之一，Eimeria acervulina 早熟株的最小首免日龄、二次免疫间隔时间及安全性如何还有待研究。

本试验对Eimeria acervulina 早熟株进行效力试验、实验室安全性试验等基础性研究，为鸡球虫早熟株疫苗研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 虫株

鸡堆型艾美耳球虫（Eimeria acervulina）早熟株（Eap20，PAsx）和强毒株（Ea02，Asx）由山西农业大学动物科技学院兽医病理实验室保存并提供。

1.2 试验动物

供试鸡为1 日龄SPF 雏鸡，由北京梅里亚维通试验动物技术有限公司提供SPF 种鸡蛋孵化而来。

1.3 Eimeria acervulina 早熟株免疫效力试验

1.3.1 最小首免日龄筛选试验 将体质量相近的120 只1 日龄SPF 雏鸡随机分为12 组，每组10 只鸡，分别为Eimeria acervulina 早熟株（PAsx）免疫攻毒组T1～T4、攻毒对照组C1～C4 和空白组C01～C04。T1～T4 组分别以1 羽份[16]于第1，2，4，6 日龄首免，首免后10 d 以2 羽份二免。二免后14 d 空腹称质量，对T1～T4 和C1～C4 组经口接种20 万个卵囊/羽强毒株（Asx）。攻毒第8 天各组鸡只称质量、剖检，进行十二指肠病变记分、卵囊排出量测定，计算相对增质量率、病变记分减少率（RLS）、卵囊减少率和抗球虫指数（ACI），来筛选其作为疫苗虫株使用的最小首免日龄。

1.3.2 免疫间隔期筛选试验 将150 只体质量相近的1 日龄SPF 雏鸡随机分为15 组，每组10 只鸡，分别为免疫攻毒组TA1～TA5、攻毒对照组TB1～TB5 和空白组CA1～CA5。于4 日龄用400 个孢子化卵囊/ 羽PAsx 对TA1 ～TA5 组首免，间隔3，5，7，9，11 d 进行二免。二免后第14 天称质量，对TA1～TA5 和TB1～TB5 组经口接种20 万个卵囊/羽Eimeria acervulina 强毒株，攻毒后观察和测定指标同1.3.1，确定疫苗虫株2 次免疫的免疫间隔期。

1.4 Eimeria acervulina 早熟株实验室安全性试验

1.4.1 一次单剂量接种 将体质量相近的4 日龄SPF 雏鸡随机分为2 组，每组10 只鸡，接种组TC1组接种PAsx 疫苗虫株推荐免疫剂量的1 羽份/只疫苗虫株，CC1 组为空白对照组。观察各试验组鸡临床症状及死亡鸡数，于接种后第14 d 称质量、剖检，观察各器官病理变化，进行十二指肠平均病变记分，计算相对增质量率。取各组鸡的肝、肾、心、十二指肠、小肠中段制作组织切片，进行病理组织学检查。

1.4.2 单剂量重复接种 将体质量相近的4 日龄SPF 雏鸡随机分为2 组，每组10 只鸡，接种组TD2组接种PAsx 疫苗虫株，CD2 组为不接种空白对照组。接种组于14，28 日龄分别以疫苗虫株推荐免疫剂量1 羽份/只、2 羽份/只接种，隔离饲养。试验期和观察指标同1.4.1。

1.4.3 一次超剂量接种 将体质量相近的4 日龄SPF 雏鸡随机分为6 组，每组10 只鸡，接种组TE3、TE4、TE5、TE6（接种虫株同TC5 组）组分别接种20倍（16 000 个卵囊/只）二次免疫推荐使用剂量的三批PAsx 疫苗虫株，CE3、CE4 组为不接种空白对照组，隔离饲养。TE3、TE4、TE5 组和CE3 组试验期和观察指标同1.4.1。TE6 组和CE4 组于接种后第7 天称质量、剖检，进行平均病变记分并计算相对增质量率。

1.5 判定指标

相对增质量率＝感染组鸡平均增质量/健康对照组鸡平均增质量×100% （1）

死亡率=组内死亡鸡数/组内总鸡数×100% （2）

OPG 是指1 g 粪便中含有的卵囊数目；肠道病变记分、十二指肠的病变记分参照JOHNSON 等[17]、蔡秀敏[4]的方法。

RLS＝（不免疫攻毒组的平均病变记分－免疫攻毒组的平均病变记分）/不免疫攻毒组的平均病变记分×100% （3）

卵囊减少率＝（不免疫攻毒组卵囊平均产量－免疫攻毒组卵囊平均产量）/不免疫攻毒组卵囊平均产量×100% （4）

ACI＝（存活率＋相对增质量率）×100－（病变值＋卵囊值）[17]（5）

免疫效果判定标准：综合分析各项指标，将死亡率为0、相对增质量率≥80%、十二指肠病变记分≤1、RLS≥70%、卵囊减少率≥75%和ACI≥180判定为免疫效果良好。

1.6 数据处理

试验结果用SPSS 17.0 统计学软件进行方差分析，并用Prism 6.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 Eimeria acervulina 早熟株效力试验研究

2.1.1 最小首免日龄筛选试验 各免疫攻毒组鸡群的精神状态良好，未见死亡，TI～T4 组的相对增质量率、卵囊减少率、病变记分减少率、抗球虫指数均逐渐增高，与首免日龄呈正相关。T3、T4 组相对增质量率均≥97.7%，平均病变记分≤0.8，RLS≥77.1%，卵囊减少率均≥95.0%，抗球虫指数均≥189.7，达到良好免疫效果（图1）。

2.1.2 不同免疫间隔期对免疫效力的影响Eimeria acervulina 早熟株以最小免疫剂量接种雏鸡，2 次免疫间隔在3～11 d，随着二次免疫间隔时间的延长，免疫攻毒组鸡的相对增质量率、卵囊减少率、病变记分减少率、抗球虫指数升高。TA1～TA5 组病变记分均＜1，且差异不显著（P＞0.05），RLS 均≥85.3，ACI 均≥182.4，卵囊减少率均≥90%，但免疫攻毒TA1、TA2 组平均增质量极显著低于TA3、TA4、TA5 组（P＜0.01）（图2）。

2.2 Eimeria acervulina 早熟株安全性试验

2.2.1 一次单剂量接种 试验鸡群精神状态良好，死亡率为0。第14 天剖检，各肠道未见眼观病变，病变记分为0.0，接种组鸡只的相对增质量率大于80%（图3）。

镜检发现，接种鸡十二指肠绒毛上皮细胞少量脱落，十二指肠和空肠均可见发育不同阶段的虫体，其余组织均未见异常。

2.2.2 单剂量重复接种 试验鸡群精神状态良好，死亡率为0。重复接种14 d 后剖检鸡只，各肠道均无眼观病变，病变记分为0.0，对照组也未见眼观病变（图3）。

镜检发现，试验鸡十二指肠肠腔结构较完整，绒毛上皮细胞少量脱落；十二指肠和空肠均可见发育不同阶段的虫体，其余组织均未见异常。

2.2.3 一次超剂量接种 三批疫苗虫株16 000 个卵囊/只剂量接种组，鸡只精神状态未见异常，死亡率为0；第7 天剖检发现，个别鸡十二指肠黏膜有少量散在白色结节，平均病变记分为1.0，其他肠道未见明显眼观病变；14 d 后剖检发现试验组与对照组鸡只各肠段均无明显眼观病变，平均病变记分为0（图3）。

镜检发现，第7 天剖检鸡只十二指肠大量肠绒毛从基底部断裂，绒毛上皮细胞大量脱落；接种后14 d 鸡只十二指肠部分绒毛断裂，绒毛上皮细胞大量脱落；第7 天与第14 天剖检鸡十二指肠和空肠均可见发育不同阶段的虫体，其余组织均未见异常。

3 讨论

弱毒活疫苗是依据活卵囊脱囊后在肠道内周期性繁殖来获得免疫保护，因此，免疫日龄的选择也是其免疫是否成功的关键一步。首免日龄不宜过小或过大，球虫脱囊需借助足够的胆汁和胰凝乳蛋白酶以及肌胃的机械碾磨，接种日龄过小时，其肌胃、肠道机能不完善，致使其无法进行内生性发育以刺激鸡体产生免疫反应；接种日龄过大，可能造成在免疫保护力产生前就已感染外界野毒。

张龙现等[18]研究发现，EimerCox plus 鸡球虫活苗最适免疫日龄为5 日龄。本试验结果表明，随首免日龄增大，各试验组的相对增质量率、卵囊减少率、RLS、ACI 逐渐增高，4～6 日龄首免均可取得良好的免疫效果，以4 日龄为最小首免日龄。

球虫病康复鸡对再感染有抵抗力[19]，但若缺乏再感染，随时间延长，鸡对球虫的免疫力会减弱；使用一定数量卵囊对鸡进行免疫时，小剂量反复接种的免疫效果优于一次大剂量接种[20]，这是因为免疫次数少，产生的免疫滴度低，不能很好的预防球虫病发生，而二次免疫可使抗体水平迅速提高，且免疫产生的抑制期较短。本试验将免疫间隔选择在3 d以上，结果表明，随着免疫间隔时间的增加，免疫攻毒鸡的相对增质量率、病变记分减少率、抗球虫指数均呈上升趋势，可见在最适时间进行二次免疫，对雏鸡有促生长作用，并可增强免疫力。本试验结果表明，虽然二免间隔3～11 d 均可达到良好的保护效果，但二免间隔3～5 d 的攻毒组鸡的相对增质量明显低于间隔7 d 以上的二免组，故将二免间隔定为7 d。

一次单剂量、单剂量重复和一次超剂量接种试验结果表明，接种鸡十二指肠绒毛断裂数量与接种剂量呈正相关，但重复接种时，鸡体已获得一定免疫力，所以，损伤相对要小；一次超剂量接种组个别鸡十二指肠损伤较严重，这是由于大量虫体在肠道内行裂殖生殖，肠黏膜原有结构被严重破坏，肠黏膜上皮细胞局灶性坏死、脱落，并进行炎症反应来抗损伤。三次安全性试验中，鸡只未见死亡，精神状态良好，除20 倍剂量接种组个别鸡只肠道损伤严重外，其余各组鸡只肠绒毛完整，无血管破裂现象，鸡群平均病变记分均≤1，相对增质量率均在80%以上。说明本疫苗虫株对健康雏鸡均安全，符合安全性要求。