血浆外泌体miR-452作为胃癌诊断的生物标志物

杨佳佳， 党旖旎， 彭 磊， 金多晨， 桑怀鸣， 陈梅红， 张国新

南京医科大学第一附属医院消化内科，江苏 南京 210029

胃癌作为一类恶性程度极高的消化系统肿瘤，发病率位于所有恶性肿瘤的第四位，致死率高居恶性肿瘤第二位，已成为严重危害人类健康的重要难题。其治疗方法不断改进，如外科手术联合放、化疗，可以延长早期胃癌患者的生存期，但晚期患者的预后仍很差[1-3]，需要探索更可靠和方便的诊断方法以改善可切除胃癌患者的长期生存情况。目前，胃镜检查联合活检病理是胃癌诊断的金标准，但此方法为侵入性检查，不宜用作常规的筛查手段。此外，一些非侵入性肿瘤标记物，如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和碳水化合物抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)等已在临床中被广泛应用，但它们在胃癌早期诊断时的敏感性和特异性均较低[4]。因此，探究用于早期检测胃癌的新型非侵入性且有效的生物标志物越来越得到人们的重视。

微小RNA(microRNA,miRNA)是高度保守的非编码序列，通常长度为18～24个核苷酸，其通过RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ从内含子、外显子、内-外显子连接或各自的基因转录成原始miRNA。在细胞核中经过Drosha和DGCR8处理后，进一步被转录成前体miRNA，随后成为成熟的miRNA，并与靶基因mRNA的5′UTR或3′UTR结合，抑制mRNA的翻译或诱导其降解[5-8]。越来越多的证据表明，miRNA对不同的肿瘤类型具有特异性，其表达谱可以区分正常组织和肿瘤组织[9-11]。有报道表明，循环miRNA可作为诊断包括癌症在内的各种疾病的生物标志物[11-13]，然而，循环miRNA的数量有限且容易受外界内源性RNA酶的酶切降解及循环功能障碍细胞释放的miRNA的影响，限制了其在临床诊断中推广的可能性。大量研究表明，外泌体可以保护包含供体细胞特性的miRNA免受酶切作用，增强循环miRNA的稳定性[13-14]，故血浆外泌体中的miRNA可以更准确地响应肿瘤进展期间肿瘤细胞的生长变化[15]。

为了探索可以区分胃癌患者的新型血浆外泌体miRNA特征，实验选择了4种已有文献发表的胃癌血浆芯片中表达水平升高的miRNAs：miR-21-5p、miR-452-5p、miR-138-5p和miR-148-3p，通过qRT-PCR对胃癌患者和健康对照者的血浆外泌体中以上4种miRNA的表达情况进行验证，并进一步分析其对胃癌进展及病理特性的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料共收集80例组织病理学证实为胃癌的患者和80名健康对照者，对照组年龄(65.0±5.6)岁，男43名，女37名，胃癌组年龄(62.9±9.2)岁，男58例，女22例。所有血浆样本均于2017-2018年从南京医科大学第一附属医院收集，排除溶血、高脂血症和其他有异常血液疾病的患者，排除已行放疗或化疗的胃癌患者。所有程序均经南京医科大学第一附属医院伦理委员会审查和批准，符合赫尔辛基宣言的要求，并在入组前获得每位参与者的书面知情同意书。

1.2 血液处理、血浆外泌体的分离和外泌体miRNA提取将血液收集在含肝素抗凝的采血管中，标记患者基本信息，并通过5 000×g，5 min离心处理，再于4 ℃，16 000×g，10 min离心以去除红细胞等残留的细胞物质，血浆转移至新的Eppendorf管后储存在80 ℃中以备后续使用(>1 ml)。本研究使用ExoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit试剂盒(Qiagen,77044，优宁维)，依据膜亲和原理，用特定的缓冲液XBP与等量血浆进行混合稀释，于exoEasy(试剂盒内提供)离心柱内离心，所得液体以3.5倍体积的缓冲液XWP洗涤，最后使用缓冲液XE孵育、洗脱并离心，彻底分离获得膜上滞留的外泌体。后续外泌体内miRNA的提取原理与常规细胞RNA提取相似(Trizol法)。由于人血浆中无已知的内源性miRNA用作标准化对照，提取RNA过程中需人为加入50 nmol/L合成秀丽隐杆线虫的cel-miR-39作为外源性标准化对照[16]，使用NanoDrop 2000紫外-可见分光光度计检测RNA浓度。

1.3 透射电子显微镜及纳米粒径分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)将样品溶解在HEPES(4- [2-羟乙基]-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液中，滴1滴悬浮液置于一片封口膜上。而后将涂有碳的铜网格浸泡于水滴内10 s，取出网格，用干净的滤纸轻轻接触网格边缘以吸去多余的液体。网格浸于一滴质量浓度为20 g/L的乙酸铀酰或磷钨酸(pH 7.0)约5 s，去除多余的液体后干燥5 min，通过Tecnai G2 Spirit Bio TWIN显微镜(FEI，日本)以×196 000的放大倍数进行观察。NTA于广州华银健康技术公司进行检测并分析。

1.4 蛋白质印迹分析(Western blotting)使用RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂PMSF(碧云天，浙江，中国)提取总的外泌体蛋白，10%SDS-PAGE凝胶进行Western blotting分析，Page RulerTMPrestained Protein Ladder(MBI Fermentas，立陶宛)作为上样Marker。一抗选择抗CD63(1∶2 000，Abcam，ab134045，吉凯基因)和TSG 101的兔多克隆抗体(Ab)(1∶2 000；Abcam，ab125011，吉凯基因)，于4 ℃孵育过夜，而后与羊抗兔二抗(1∶10 000；bioword，bs13278，巴傲得生物)一起温育2 h。SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate试剂盒(Thermo Scientific，上海，中国)使结合的蛋白质曝光。

1.5 实时定量PCR(qRT-PCR)本研究逆转录使用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(Takara，RR037A，日本)，按实验步骤将每个外泌体RNA样本取100 ng于20 μl的体系中进行逆转录，逆转录miRNA引物设计来自上海吉玛(miR-452-5p：RT引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCA

GTTTC-3′；PCR引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAACTGTTTGCAGAGGA-3′)。qRT-PCR反应在384孔板中进行，其中1 μl RT产物与定量PCR所用的SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara，RR420A，日本)中的SYBR及miRNA上、下游引物(吉玛，上海)混合离心后，以5 μl/孔的体系，至ABI-7900实时荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR反应，以cel-miR-39作为外源对照，比较所得的Ct值。

1.6 统计学分析本研究总体为分类变量数据，使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,San Diego，美国)软件进行所有统计学分析并生成图表。使用独立样本T检验及χ2检验比较胃癌和对照组之间血浆外泌体miRNA的表达和分布差异，以及差异miRNA表达与各临床变量及病理特征之间的关系。根据qRT-PCR结果(2-△Ct)建立miR-452-5p的诊断ROC曲线并计算曲线下面积(AUC)，以确定其在人群中预测胃癌的灵敏性与特异性。以所有胃癌患者miR-452-5p的qRT-PCR结果(2-△Ct)中位数为界，将胃癌分成miR-452-5p高表达组与低表达组，在SPSS 20.0中通过交叉表分析比较不同表达组的人群基本信息及病理特性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体抽提与鉴定本研究通过透射电子显微镜、Western blotting和NTA对提取的血浆外泌体特性进行鉴定。在透射电镜下放大196 000倍后观察提取的1例胃癌患者和1名健康对照个体的血浆外泌体(如图1A黑色箭头所示)，发现血浆外泌体样本为茶托样双层脂质膜结构，大小均<200 nm；TSG-101和CD63蛋白分别为定位于外泌体膜内和膜上的蛋白标志物，经Western blotting曝光后成功显现(见图1B)；NTA示外泌体粒径为140.8～231.5 nm，在155.2 nm处富集，对其定量后浓度约为3.72×108个颗粒/ml(见图1C)。

图1 血浆外泌体的鉴定
A：在透射电子显微镜(比例尺=200 nm)下观察提取的血浆外泌体，黑色箭头所指为外泌体；B：通过Western blotting在不同样本所纯化的外泌体裂解物中检测外泌体特异性生物标志物TSG-101和CD63；C：NTA所提取的外泌体的浓度和根据直径所获取的粒子分布

Fig 1 Identification of plasma exosomes
A: plasma exosomes observed under transmission electron microscopy (scale bar = 200 nm), black arrowed refer to exosomes;B: the exosomal biomarkers TSG-101 and CD63 detected in the exosomal lysate by Western blotting in different samples;C: the concentration and the particle distribution of exosomes detected by NTA

2.2 血浆外泌体差异性miRNA筛选首先，研究使用qRT-PCR检测来自胃癌患者(n=12)和健康对照者(n=12)的血浆外泌体中文献已发表的胃癌血浆芯片中表达水平升高的4种miRNAs：miR-21-5p、miR-452-5p、miR-138-5p和miR-148-3p的表达情况，发现与健康对照者相比，胃癌患者血浆外泌体中miR-452-5p的表达显著增加(P<0.001)(见图2A)。为了探究血浆外泌体miR-452-5p作为标志物预测胃癌的能力，实验基于血浆外泌体样品中miR-452-5p的表达量(2-△Ct)以制作ROC曲线评估其对胃癌的预测能力，得到的AUC为0.798(95%CI：0.552～0.883,P=0.019)(见图2B)，提示血浆外泌体可有效鉴别胃癌患者与健康对照人群。

2.3 胃癌中miR-452-5p特征的验证将筛选阶段所确定的miR-452-5p在新的68例胃癌患者和68名健康对照人群中使用qRT-PCR进行分析验证。基线信息如表1所示。胃癌患者和健康对照者之间miR-452-5p的差异表达模式与筛选结果一致(P<0.0001)(见图3A)。对来自筛选和验证组的所有160个样品的数据进行分析产生新的ROC曲线，曲线下AUC值为0.733(95%CI：0.647～0.818，P<0.001)(见图3B)，提示miR-452-5p的表达在胃癌中确有升高的趋势，血浆外泌体内miR-452-5p有望成为胃癌诊断潜在的生物标志物。

图2 在筛选阶段用于胃癌诊断的血浆外泌体miRNA表达特征 A：来自胃癌患者(n=12)的血浆外泌体和来自健康对照者的样品(n=12)中miR-21-5p、miR-452-5p、miR-138-5p和miR-148-3p的表达情况；B：筛选阶段中miR-452-5p的ROC分析，每个值代表Fig 2 The expression characteristics of plasma exosomal miRNA for gastric cancer diagnosis at the screening stage A: the expressions of miR-21-5p, miR-452-5p, miR-138-5p and miR-148-3p in plasma exosomes from gastric cancer patients (n=12) and healthy controls (n=12); B: ROC analysis of miR-452-5p in the screening phase, each value representing

表1 胃癌患者及健康对照者的基线信息

续表1

变量健康对照组(n=80)胃癌组(n=80)P值 无79 (98.8)68 (85.0) 有1 (1.2)12 (15.0)吸烟史[n(%)]0.035 无68 (85.0)57 (71.3) 有 12 (15.0)23 (28.7)饮酒史[n(%)]0.017 无73 (91.2)62 (77.5) 有7 ( 8.8)18 (22.5)

注：胃癌及健康对照的基线信息统计及人群分布分析(年龄比较采用T检验，其余均为χ2检验)。

2.4 胃癌患者血浆外泌体miR-452-5p的表达与临床病理因素的关系收集验证阶段65例数据齐全的胃癌患者血浆外泌体，临床特征如表2所示。以miR-452-5p的表达中位数为界，将胃癌患者分成高表达组与低表达组，对患者的烟酒史、NSAIDs服用史及家族史等信息进行分析，发现高表达组与低表达组的人群分布差异均无统计学意义，仅在糖尿病中差异有统计学意义(P=0.015)。而在临床病理因素中，各项变量的人群分布差异均无统计学意义，仅在“病变大小”这一病理检测变量中有差异趋势(P=0.052)。对此并不能贸然否定miR-452-5p对于胃癌疾病特性的影响，分析造成该现象的原因可能系研究样本量不足所致，需要更大的样本量进一步研究证实。

图3 在验证阶段用于胃癌诊断的血浆外泌体miR-452-5p的表达特征 A：来自胃癌(n=68)和正常样品(n=68)的血浆外泌体中miR-452-5p的表达；B：miR-452-5p在所有样本中的ROC分析曲线，每个值代表Fig 3 Expression characteristics of plasma exosomes miR-452-5p for gastric cancer diagnosis during the validation phase A: expression of miR-452-5p in plasma exosomes from gastric cancer (n=68) and healthy controls (n=68); B: ROC analysis curve of miR-452-5p in all samples, each value representing

表2 胃癌患者血浆外泌体中miR-452-5p的表达(qRT-PCR)与各临床变量及病理特征之间的关系

续表2

变量miR-452-5p 低表达(n=21)高表达(n=44)P值肿瘤家族史[n(%)]0.549 无18 (85.7)35 (79.5) 有3 (14.3)9 (20.5)病变大小[n(%)]0.052 ≤5 cm15 (71.4)37 (84.1) >5 cm6 (28.6)7 (15.9)病变部位[n(%)]0.775 贲门6 (28.6)15 (34.1) 非贲门15 (71.4)29 (65.9)浸润深度[n(%)]0.504 T1～T29 (42.9)23 (52.3) T3～T412 (57.1)21 (47.7)分化程度[n(%)]0.246 好3 (14.3)10 (22.7) 差18 (85.7)34 (77.3)脉管浸润[n(%)]0.573 无13 (61.9)32 (72.7) 有8 (38.1)12 (27.3)淋巴结转移[n(%)]0.713 无9 (42.9)21 (47.7) 有12 (57.1)23 (52.3)神经侵犯*[n(%)]0.162 无9 (45.0)28 (63.6) 有11 (55.0)16 (36.4)肿瘤分期[n(%)]0.736 Ⅰ～Ⅱ11 (52.4)25 (56.8) Ⅲ～Ⅳ10 (47.6)19 (43.2)

注：miR-452-5p的表达在胃癌患者各临床变量和病理特性中的人群分布情况及差异性总结(年龄比较采用T检验；其余均为χ2检验)。*：其中1例患者该项描述缺失。

3 讨论

早期诊断和治疗可以提高胃癌患者的生存率。目前，胃癌的诊断分侵入性和非侵入性检查，均因灵敏性较低难以普及。miRNA的表达相对稳定，且已在循环中以脱离细胞的形式被发现[17-20]，因而作为胃癌生物标志物被大量研究。但循环miRNA的数量受内环境影响较大，易被外界内源性RNA酶降解，为解决这一问题，研究者将目光转向了外泌体。外泌体为一类胞外双层脂质膜性小囊泡，直径30～150 nm，可携带供体细胞内所含分子如癌蛋白和肽、各种RNA(miRNA、mRNA、lncRNA等)、脂质和DNA片段等，保护它们不受细胞外各种酶的降解，并通过与受体细胞表面分子相互作用或直接融合的方式活化细胞内信号通路，介导细胞间交流，引发肿瘤微环境中深入的表型变化，故研究者认为外泌体可以更准确地响应肿瘤进展期间癌细胞中miRNA的表达变化。

本研究旨在探索血浆外泌体miRNA是否可能成为临床上适用于胃癌诊断的生物标志物。首先对提取的血浆外泌体进行一系列鉴定，确定所提取的沉淀具有外泌体特性。在此基础上，通过qRT-PCR分析验证其内包含miRNA的表达情况，发现与健康对照人群相比，胃癌患者血浆外泌体中miR-452-5p的表达显著上调，对其建立ROC曲线模型后，AUC为0.733(95%CI：0.647～0.818)，表明miR-452-5p具有较高的胃癌诊断灵敏性和特异性。此外，由于本实验验证的miRNA主要存在于血浆外泌体中，可以防止外界各因素的干扰，故其表达变化情况较游离miRNA更为稳定可靠。然而，在分析胃癌患者中miR-452-5p的表达与疾病病理特性的关系时，发现高表达组与低表达组的病理特征差异均无统计学意义，对此若草率认定miR-452-5p的表达对胃癌的疾病发展无影响显然是不严谨的，提示后续需要扩大样本量并寻求更精确的检测与分析进一步加以验证。

已有研究表明血浆中miRNA-940能够作为新的胃癌诊断标志物，其较外泌体miRNA标志物的检测操作方便。然而，血浆miRNA-940作为一种循环miRNA标志物，易受细胞外液中RNase及其他异常功能细胞分泌的miRNA干扰,其在血浆中的表达也非持久稳定，饮食、睡眠等生活习惯的改变均可能引起循环miRNA的短期变化，从而影响研究者对于疾病发展的判断。本研究探索外泌体miR-452-5p作为胃癌诊断的标志物，因其包裹于外泌体内，受血浆中其他分子的影响较小，且外泌体直接来源于肿瘤组织相关的细胞，所携带的miR-452-5p及其表达趋势更能直观地反映胃癌的疾病特性，外源性非剧烈刺激对其影响不大，故其相对于循环miRNA-940标志物更稳定、精确。

总之，本研究为分离血浆外泌体miR-452-5p用于早期诊断胃癌提供了切实的理论基础，为临床上胃癌的检测和诊断提供了更为准确和便利的途径，其突破传统的有创性检查(如胃镜下取组织活检)，使胃癌的检查变得低创甚至无创，较传统的标志物CA19-9和CEA等，其灵敏性和特异性也得到了极大的提高[21]，对胃癌的早期发现和干预有重要意义。当然，此次研究也有许多不足之处：(1)样本量较小，使miR-452-5p在胃癌不同病理特征中的表达差异不明显；(2)由于患者入组时间较短，无法对入组患者作进一步的生存分析及影响生存情况的风险因素分析；(3)未能在细胞中进一步对所检验的miR-452-5p进行功能及机制的验证等。这些类似的问题，都有可能对实验结果产生影响，未来需要进一步的研究来不断完善外泌体相关的实验方法及理念，深入探讨外泌体在肿瘤领域发挥的重要作用。