铜绿假单胞菌临床感染的耐药性及毒力基因分析

林雅宁，刘惠娜，占景华，徐忠玉

(第九○九医院/厦门大学附属东南医院检验科，福建漳州 363000)

铜绿假单胞菌(PA)是临床上常见的条件致病菌，在自然界分布广泛，对环境抵抗力较强[1]。随着广谱抗菌药物的普遍使用，该菌耐药性明显上升。PA的致病机制与Ⅲ型分泌系统(T3SS)密切相关，毒力基因exoS和exoU在PA致病中起着重要作用。为了提高医院抗菌治疗效果和指导临床合理使用抗菌药物，现对2016-2017年本院临床分离的1 000株PA和43株多药耐药PA菌株的毒力基因进行研究分析。

1 资料与方法

1.1一般资料 1 000株PA来自2016-2017年全院临床各科室送检的住院患者标本，包括痰液标本726株，分泌物144株，中段尿44株，血液28株，胸腹腔积液26株，其他32株。同一患者多次分类的菌株不重复计入。

1.2方法

1.2.1菌株鉴定及药敏试验 细菌培养鉴定按照《全国临床检验操作规程》进行，运用WalkAway 96 Plus全自动微生物分析仪对菌株进行鉴定及药敏试验，以PA ATCC 27853作为质控菌株。

1.2.2毒力基因exoS和exoU的检测 采用煮沸法提取DNA模板，委托上海生工合成两对特异度引物对其进行PCR扩增，上下游引物参考文献[2]。

1.2.3统计学处理 在Excel上进行数据分析及统计学处理，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1耐药率 1 000株PA对9种常用抗菌药物均有不同程度的耐药，其中对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、美罗培南和亚胺培南有较好的药物敏感活性，对头孢他定和头孢吡肟耐药率较高。见表1。

表1 1 000株PA对9种抗菌药物的耐药率

2.2毒力基因exoS和exoU的检测 以exoS和exoU特异度引物扩增相应片段，43株多药耐药PA中exoS(+)33株，exoU(+)6株。根据PCR结果统计这43株PA的毒素基因携带情况，其中exoS(+)/exoU(-)基因型共有33株，占78.6%；exoS(-)/exoU(+)基因型有6株，占14.3%；exoS(-)/exoU(-)基因型有4株，占7.1%。

2.3不同基因型的耐药率比较 exoS(-)/exoU(+)基因型对抗菌药物耐药率基本高于exoS(+)/exoU(-)组，尤其对环丙沙星、头孢他啶、美罗培南和头孢吡肟的耐药性exoS(-)/exoU(+)明显高于exoS(+)/exoU(-)，耐药率差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组含毒力基因的PA对9种抗菌药物的耐药情况

3 讨 论

PA是一种重要的医院感染条件致病菌，可以感染人体任何组织部位。医院2016-2017年共检出1 000株，标本类型构成比由高至低依次为痰液726株(72.6%)，分泌物144株(14.4%)，尿液44株(4.4%)，血液标本28株(2.8%)，胸腹腔积液26株(2.6%)，其他标本32株(3.2%)。其中分离到的痰液标本略低于同类报道的78.01%[3]，但远比余昊等[4]报道的61.7%高。说明呼吸道为PA医院感染的高发部位，应注意预防呼吸道发生医院感染。

PA耐药情况很严重，这与PA的内外因密切相关，外因就是抗菌药物的广泛使用，内因就是该菌具有特殊的细胞壁和细胞膜结构，对许多抗菌药物存在固有耐药，其耐用机制复杂。表1显示PA对阿米卡星的药物敏感度最好，可能是阿米卡星对该菌产生的钝化酶比较稳定，与杨燕等[5]、孙敏等[6]报道一致。其次对哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星、美罗培南和亚胺培南也有较好的药物敏感度，这与全国2012-2013年的“中国CHINET细菌耐药性监测”资料吻合[7-8]。对三代头孢他啶耐药率为42.2%，略高于王静等[9]报道的32.39%。这可能与近年来该抗菌药物的广泛使用有关。

PA致病是由多种致病因子实现的，其中T3SS是PA的一个重要毒力因子分泌系统，可以将编码的毒力蛋白直接注入宿主细胞中，导致细胞死亡[10]。本研究对临床分离的43株多药耐药PA进行毒力基因exoS和exoU检测与分析。结果表明，exoS基因携带率78.6%远高于exoU基因的14.3%，且只存在exoS(+)/exoU(-)、exoS(-)/exoU(+)或exoS(-)/exoU(-) 3种基因型。据报道，对于exoU和exoS基因，一般情况下，每株PA只携带其中的一种基因，exoS和exoU不同时存在同一菌株[11-12]。本研究没有发现基因型为exoS(+)/exoU(+)的菌株。但是鞠晓红等[13]分离的63株铜绿假单胞中34株菌(53.97%)同时携带两种毒力基因。

通过对两组含不同毒力基因的PA对9种抗菌药物的耐药率的分析，exoS(+)/exoU(-)和exoS(-)/exoU(+)基因型的PA对美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星和头孢吡肟等的耐药率差异具有统计学意义。国外研究，WONG等[14]研究者分离到的临床PA携带exoS菌株高于exoU(62%vs.27%)，且对左氧氟沙星耐药率exoS菌株高于exoU菌株(92.0%vs.61.0%)。可能的机制为exoS(-)/exoU(+)菌株多表现为主动外排泵相关基因的过度表达或者突变[15]。本研究也表明exoU菌株对于环丙沙星等喹诺酮类抗菌药的耐药率高于exoS，但未对其具体机制进行深入研究与探讨。

综上所述,PA在医院表现出多药耐药，且以exoS为主，虽然携带exoU的菌株所占比例较低，但其耐药率高，对其具体机制值得深入研究与探讨。