响应面法优化土壤有效硒浸提条件及生物有效性研究

刘淑琴　陈永波　黄光昱　熊倩　张朝阳　陈娥　秦邦　邹雪园

摘要：以土壤为材料，采用KH2PO4溶液提取土壤中的有效硒。以有效硒的提取量为响应值，浸提液浓度、pH、浸提时间和液料比为自变量，建立数学模型，利用响应面法获得土壤有效硒的最佳提取条件。结果表明，土壤有效硒的最佳提取条件为浸提液浓度0.5 mol/L，pH 9.9，浸提时间72 min，液料比27∶1，在此优化条件下有效硒提取量为0.56 mg/kg，与响应面分析预测值0.53 mg/kg基本相符。作物盆栽试验也表明，土壤有效硒的KH2PO4溶液浸提法可以作为评价土壤对作物有效态硒的指标。

关键词：土壤;有效硒;生物有效性;响应面法

中图分类号：S151.9+3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）15-0107-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.15.025           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of soil available selenium extraction conditions and

bioavailability by response surface methodology

LIU Shu-qin，CHEN Yong-bo，HUANG Guang-yu，XIONG Qian，

ZHANG Chao-yang，CHEN E，QIN Bang，ZOU Xue-yuan

（Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： Using soil as material， KH2PO4 solution was used to extract available selenium from soil. Taking the available selenium extraction amount as the response value， the extract concentration， pH value， extraction time and liquid sample ratio were independent variables， and the mathematical model was established. The optimal extraction conditions of soil available selenium were obtained by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions for soil available selenium were： extract concentration 0.5 mol/L， pH 9.9， extraction time 72 min， liquid sample ratio 27∶1， and the available selenium extraction amount was 0.56 mg/kg under the optimized conditions， which is basically consistent with the response surface analysis predicted value of 0.53 mg/kg. The crop pot experiment showed that the KH2PO4 solution extraction method for soil available selenium can be used as an index to evaluate the soil available for crop selenium.

Key words： soil; available selenium; response surface

硒是人體必需的微量元素，对人类的身体健康具有重要意义，富硒土壤是植物中硒的主要来源之一。硒在土壤中存在的形态有水溶态、可交换态、矿质结合态、有机结合态和残渣态，其各种硒形态的总和称为总硒，其中能直接被作物吸收利用的称为生物有效硒[1-3]。大量的研究报道表明，作物含硒量与土壤总硒没有显著的相关性，而与土壤有效硒相关性显著[4-9]。关于土壤有效硒的研究目前尚没有统一的测定方法，常用连续浸提或单一浸提的化学法，提取剂有水、CaCl2、NaHCO3、K2SO4、KH2PO4和磷酸盐缓冲液等[10-15]，对不同类型的土壤有效硒浸提虽没有形成共识，但一般采用NaHCO3溶液和KH2PO4溶液浸提，温国灿等[14]在酸性土壤有效硒优化的研究中提出了HCO3-和H2PO4-对土壤硒的提取机理，HCO3-主要是使与硒结合的铁和铝水解而释放出硒，水解性高，提取的硒量也越高，因此提取的硒量未必能很好的反映作物对土壤硒的吸收量，而H2PO4-是通过阴离子交换作用将被吸附在土壤固相表面的硒取代出来，交换所取代的硒在一般土壤条件下也较容易释放出来，更能代表土壤硒的有效性。因此，本研究采用KH2PO4溶液提取土壤中的有效硒，利用响应面分析法对提取条件进行优化，并进行了盆栽试验，旨在为土壤有效硒的提取提供理论参考和技术依据。

1  材料与方法

1.1  材料

土壤采于湖北省恩施州双河镇，土壤类型为壤土，土壤经自然风干后捶碎过60目筛装于密封袋中，备用。

1.2  仪器

MDS-15型微波消解仪，SINEO新仪;AFS-930D型原子荧光光度计，北京吉天仪器公司。

1.3  试剂

磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司;硝酸，优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司;盐酸，优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司;过氧化氢，分析纯，天津恒兴化学试剂制造有限公司;硒标准溶液，核工业北京化学冶金研究院;硼氢化钾，分析纯，山东西亚化学工业有限公司。

1.4  方法

1.4.1  土壤有效硒的测定  称取土壤样品0.25～1.00 g于离心管中，准确加入0.1～0.8 mol/L的KH2PO4浸提液（pH 4～10）10 mL，在恒温振荡器1 500 r/min、30 ℃振荡30～120 min，3 000 r/min离心15 min，取上清液5 mL于微波消解罐中，加入HNO3 7 mL、H2O2 1 mL进行消解，样品消解完毕后，取下消解罐，在电热板上加热至近干，冷却后加入5 mL 6 mol/L盐酸，继续加热至溶液清亮无色并伴有白烟出现，冷却，转移至10 mL容量瓶中，加入铁氰化钾溶液1 mL，用5%盐酸溶液定容，用氢化物-原子荧光光谱法测定硒含量。

1.4.2  土壤有效硒的提取响应面试验  采用响应面曲面中心组合试验软件设计方案进行中心组合试验，因素与水平见表1。

1.4.3  盆栽试验  供试土壤采自湖北省恩施州天池山，盆栽作物为韭菜，设4个处理，每个处理分别加入亚硒酸钠0、0.5、1.0、2.0 mg/kg和硒酸钠0、0.5、1.0、2.0 mg/kg，重复3次，每盆施肥量相等。30 d后采集地上部分，并测定其干态全硒含量（参照GB 5009.93-2017法测定），同时采集盆中土壤，风干后过60目筛以测定有效态硒。

2  结果与分析

2.1  响应面试验有效硒的提取结果

中心组合响应面试验有效硒提取结果见表2。运用Design-expert 8.05b软件采用Box-Behnken Design（BBD）设计对表2中数据进行响应面分析，通过多元回归拟合分析得到模型并进行方差分析，得到土壤中有效硒的优化数学回归方程为：R=0.49+0.033A+0.056B+0.028C+0.050D-0.005AB+0.012AC-0.005AD-0.029BC-0.021BD+0.017CD-0.019A2+0.007B2-0.027C2-0.027D2。

对模型进行F检验和方差分析，结果见表3。由表3方程一次项系数得出，影响土壤有效硒提取率因素的顺序为：pH>液料比>浸提液浓度>浸提时间。表3方差结果分析显示，回归方程的F值为7.09，P>F项的值小于0.01，说明该模型极显著，其中A、B、D对整个试验影响极显著，C小于0.05，影响显著。经过响应面分析及回归模型预测，得到土壤有效硒的最佳提取条件为：浸提液浓度0.52 mol/L，pH 9.94，浸提时间72.21 min，液料比27.44∶1，结合实际操作最终确定为：浸提液浓度0.5 mol/L，pH 9.9，浸提时间72 min，液料比27∶1，有效硒浸提量实际值为0.56 mg/kg，预期值为0.53 mg/kg，说明该模型可以很好地预测土壤有效硒的提取量。

2.2  不同因素间的响应面分析

模型中各因素间的交互作用如图1至图6所示，响应面越陡，表明两因素间的交互作用越显著，AC、AD、CD 3个曲面的抛物面均开口向下，表明浸提液浓度、浸提时间和液料比具有极大值点，AB、BC和BD曲面向上，表明浸提液pH还没有达到最大值。

2.3  盆栽试验结果分析

4个处理的盆栽韭菜的含硒量分别为0.67、1.92、3.10、5.01 mg/kg，对应的土壤有效硒分别为0.90、1.17、1.65、1.77 mg/kg，其韭菜含硒量与土壤有效硒含量的相关性见图7，以土壤有效硒为自变量x，植物干态硒含量作为因变量y进行一元线性回归分析，线性回归方程为：y=4.298 9x-3.225 3

韭菜含硒量与土壤有效硒含量的相关系数R2为0.902 6，相关性较好，达到了显著水平，因此用磷酸二氢钾提取的硒能反映植物从土壤吸收硒的情况，可以作为土壤有效硒的评价指标。

3  小结

通过响应面法优选出了土壤有效硒的最佳提取条件，结果表明，土壤有效硒的最佳提取条件为浸提液浓度0.5 mol/L，pH 9.9，浸提时间为72 min，液料比为27∶1，在此优化条件下有效硒提取量为0.56 mg/kg，与响应面分析预测值0.53 mg/kg基本相符。韭菜盆栽试验也表明，韭菜中的含硒量与土壤有效硒的含量的相关系数达到了0.902 6，由此可以得出，土壤有效硒的KH2PO4溶液浸提法可以作为评价土壤有效态硒的评价指标。

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